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Sep 19, 2023

撤回された論文: 抗酸化物質を含む天然食品甘味料

Oncogenesi Volume 5, pagina

Oncogenesis volume 5、e217 ページ (2016)この記事を引用

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この記事は 2023 年 3 月 16 日に撤回されました

この記事の訂正は 2017 年 4 月 10 日に公開されました。

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モグロシド V は、伝統的な中国の薬用植物 Siraitia grosvenorii から単離されたトリテルペノイドです。 モグロシド V は甘味度が高く、カロリー含有量が低いです。 本明細書において、我々は、モグロシド V が膵臓がん細胞 (PANC-1 細胞) のアポトーシスと細胞周期停止を促進することにより、膵臓がんの in vitro および in vivo モデルにおいて腫瘍増殖阻害活性を有しており、その活性の一部は STAT3 の調節によって媒介されている可能性があることを発見した。シグナル伝達経路。 これらの結果は、膵臓癌のマウス異種移植モデルにおいて in vivo で確認されました。 異種移植腫瘍では、腫瘍細胞増殖の最も一般的に使用されるマーカーである Ki-67 および PCNA が、モグロシド V の静脈内投与後に下方制御されました。ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニックエンド標識アッセイにより、モグロシド V 治療が膵臓がん細胞のアポトーシスを促進することが示されました。異種移植腫瘍。 さらに、モグロシド V 治療により、異種移植片における CD31 標識血管および血管新生促進因子血管内皮増殖因子の発現が大幅に低下することがわかり、モグロシド V が血管新生を阻害し、血管内皮増殖因子を減少させることにより膵臓腫瘍の増殖を制限する可能性があることが示されました。密度。 したがって、これらの結果は、天然の甘い味の化合物モグロシド V が、複数の生物学的標的を標的とすることによって膵臓がん細胞の増殖と生存を阻害できることを示しています。

がんは人間の健康に重大な脅威をもたらし、生活の質に深刻な影響を与えます。 たとえば、がん患者は疲労、脱力感、強い痛みを経験します。 さらに、がんの治療に使用される化学療法薬には多くの副作用があり、生活の質にも重大な影響を及ぼします。 したがって、持続的で効果的な化学療法を確実に行うためには、抗がん剤の有効性を高め、化学療法の副作用を軽減することが特に重要です。

化学療法は最も重要な抗腫瘍療法の 1 つです。 化学療法薬は生活の質を大幅に改善し、生存期間を延長できるため、毒性が低く、効率が高く、化学療法薬の探索が腫瘍学研究の主要な焦点となっています。 植物中の薬理活性化合物のスクリーニングは新薬開発にとって重要なアプローチですが、薬理活性化合物を含む可能性のある植物は広く分布しており、その数も多く、化合物も複雑です。 したがって、植物由来の薬剤をランダムにスクリーニングするのは手間がかかります。 伝統的な中国医学は、数千年にわたって臨床効果が証明されている植物を使用するため、医薬品開発に大きなリソースを提供します1,2。したがって、漢方薬において特に高い効果を持つ単一化合物をスクリーニングすることは、漢方薬を開発するための重要なアプローチとなる可能性があります。新しい治療法。

伝統的な中国医学で一般的に使用される植物の中には、主に広西省で栽培されている中国固有の植物であるシライティア・グロヴェノリがあり、これが世界のS.グロヴェノリ生産量の90%以上を占めています。 1997 年、中国保健省は、さまざまな種類の食品の甘味料として S. グロベノリイ サポニンを承認しました。 S. グロベノリのサポニンは、S. グロベノリの主な甘味化合物であり、スクロースよりも数百倍甘いです。

S. grosvenorii は、中華人民共和国薬局方に含まれる「薬用および食用」薬物の最初のグループの 1 つであり 3、同薬局方では、S. grosvenorii の主な効果を「熱を放出し、肺に潤いを与え、咽頭に有益である」と列挙しています。声と排便を促進し、下剤として作用します。」 現在、S. grosvenorii に関する研究は、その抗酸化作用 4,5 、抗炎症作用 6、血中脂質および血糖値の低下の可能性に焦点を当てています。 注目すべきことに、彼らは明確な作用機序を提供できず、この薬用植物の完全な薬理学的効果を特徴付けることができていない。 特に、抗膵臓がん薬の開発における S. grosvenorii の使用は検討されていません。

膵臓がんは、糖代謝に影響を与える悪性疾患です。8,9 したがって、慢性的な砂糖の過剰摂取は膵臓がんのリスクを高めるため、膵臓がん患者は過剰な糖分の摂取を避ける必要があります。 しかし、ほとんどの人は日常生活で甘い食べ物や飲み物を摂取します。 したがって、臨床的に承認された甘味料とともに抗がん治療を提供する手段は、膵臓がん患者にとって特に有益であると考えられる。 本明細書では、S. grosvenorii から抽出されたモグロシド V が、in vivo および in vitro の両方で STAT3 経路を介して膵臓癌細胞の増殖および生存を阻害することが観察されました。 これらの結果は、モグロシド V が副作用が比較的少なく、毎日使用できる有望な抗がん剤である可能性があることを示しています。

MTT アッセイを使用して、液体細胞培養における PANC-1 細胞およびその他の腫瘍タイプの増殖に対するモグロシド V (図 1a) の影響を調べました。 図1bに示すように、モグロシドVは、用量依存性および時間依存性で膵臓がん細胞および他の腫瘍細胞種の増殖を阻害し、非腫瘍形成性上皮細胞株L02に対しては細胞毒性をほとんど示さなかった。 モグロシド V の抗増殖効果がアポトーシスおよび/または壊死の誘導に関連しているかどうかをさらに決定するために、モグロシド V 処理細胞をターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニックエンド標識 (TUNEL) アッセイで分析しました。 モグロシド V で 24 時間処理した後、TUNEL 陽性細胞の割合は濃度依存的に増加し、未処理の対照細胞の 2.91% から 250 μmol/l のモグロシドで処理した細胞の 92.25% までの範囲でした。 V (図 1c)。

モグロシド V は培養細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導します。 (a) S. grosvenorii から抽出されたモグロシド V の化学構造。 (b) モグロシド V で処理した PANC-1 およびその他の腫瘍細胞タイプにおける細胞増殖阻害率を示す MTT アッセイ結果のグラフ。(c) TUNEL 反応アポトーシス アッセイ用のスライド上にプレーティングされた細胞の代表的な画像。 アポトーシスを起こしている細胞の割合は、モグロシド V 濃度が増加するにつれて増加しました。 結果は 3 つの独立した実験で得られました。

モグロシド V による細胞増殖および生存率の阻害をさらに調査するために、0 ～ 250 μmol/l の範囲のモグロシド V 濃度で処理した PANC-1 細胞のアポトーシスおよび細胞周期分布をフローサイトメトリーを使用して調べました。 アネキシン V フローサイトメトリー アッセイにより、モグロシド V が PANC-1 細胞でアポトーシスを引き起こすことが明らかになりました。 図2aおよびbに示すように、モグロシドVは濃度および時間依存的にPANC-1細胞のアポトーシスを誘導しました。 さらに、一般的なカスパーゼ阻害剤であるz-VAD-fmkが、モグロシドVによる48時間の処理によって誘導されるPANC-1細胞のアポトーシスを阻害することも発見しました（図2c）。 さらに、モグロシド V 濃度依存的な G0/G1 比の増加が観察され、最高用量 (250 μmol/l) に曝露した後は、未処理細胞と比較して 1.7 倍の増加に達しました (図 2d)。

モグロシド V で処理した PANC-1 細胞のアポトーシスおよび細胞周期分析。(a) モグロシド V が濃度依存的に PANC-1 細胞のアポトーシスを誘導したことを示すアネキシン V アッセイからの代表的なフローサイトメトリー プロット、および (b) 時間依存的なやり方。 （ c ）PANC-1細胞を、アポトーシス阻害剤zVAD（20μmol / l）の存在下または非存在下で、モグロシドV（20μmol / l）の存在下または非存在下で48時間処理しました。 (d) フローサイトメトリーを使用して分析された細胞周期段階を示すグラフ。 細胞周期の G0/G1、S、または G2/M 期にある細胞の割合が示されます。 モグロシド V 処理細胞では G0 ～ G1 集団の増加が観察されました。 結果は 3 つの独立した実験で得られました。

STAT3 経路は細胞の成長、増殖、生存に重要な役割を果たしており、いくつかの種類のヒトの癌に関与しています 10,11。したがって、我々は、PANC-1 細胞におけるこのシグナル伝達経路に対するモグロシド V 治療の効果をウェスタンブロットアッセイによって評価しました。 。 PANC-1 細胞におけるリン酸化 STAT3 (p-STAT3) のレベルは、モグロシド V で 24 時間処理した後に減少することがわかりました (図 3)。 さらに、モグロシド V が細胞周期制御および STAT3 経路の下流にあるアポトーシス経路に関与するタンパク質の発現を調節するかどうかを調べました。 G0-G1 期の細胞周期停止に関連するサイクリンキナーゼ阻害剤 CDKN1A (p21WAF1) および CDKN1B (p27)、12、13、14 の発現は 15、24 歳以降、モグロシド V により用量依存的に増加しました。 h. 対照的に、増殖促進性の細胞周期調節因子である CCND1 (サイクリン D1)、CCNE1 (サイクリン E1)、および CDK2 の発現は、モグロシド V 処理後に減少しました 16。 さらに、抗アポトーシスタンパク質 BCL2L1 および BCL2 の発現も減少しました。一方、アポトーシス促進性の CASP3 および BAX タンパク質のタンパク質は、24 時間のモグロシド V 処理後に増加しました。 さらに、モグロシド V は、JAK2 および TYK2 を含む、STAT3 の上流のキナーゼのリン酸化を抑制しました (図 3c および d)。

STAT3経路に対するモグロシドVの効果。 PANC-1 細胞をさまざまな濃度のモグロシド V に 24 時間曝露し、特異的抗体を使用したイムノブロットによって標的タンパク質を検出しました。 (a) モグロシド V 処理細胞では、STAT3 (p-STAT3) のリン酸化と STAT3 経路下流のタンパク質の発現が抑制されました。 (b) モグロシド V による PANC-1 細胞における STAT3 シグナル伝達経路の調節の暫定的な描写。(c) STAT3 の p-STAT3 へのリン酸化と STAT3、P-JAk2、JAK2、P-TYK2、および STAT3 のタンパク質発現モグロシド V 処理した PANC-1 細胞および MiaPaCa-2 細胞 (d) の TYK2 を、ウェスタンブロッティングを使用して調べました。 ベータアクチン発現はローディングコントロールとして機能しました。 結果は 3 つの独立した実験で得られました。

インビボでの腫瘍増殖を阻害するモグロシド V の能力を決定するために、実験マウスに異なる用量のモグロシド V を週 3 日、5 日間静脈内注射することにより、ヌードマウス異種移植モデルにおける PANC-1 腫瘍に対するモグロシド V の抗腫瘍活性を評価しました。数週間。 モグロシド V で治療したマウスでは、評価したすべての用量で対照マウスと比較して腫瘍増殖が有意に阻害されました (図 4a)。 異種移植の35日後にマウスを屠殺し、腫瘍を解剖した。 対照マウスの平均腫瘍体積は、高用量モグロシド V 治療マウスの 56.4±0.11 mm3 と比較して、278.6±0.03 mm3 でした (79.7% 減少; P<0.001)。 対照群の腫瘍全体の重量は32.2±1.4 gでしたが、高用量のモグロシドV治療を受けたマウスではわずか9.2±1.8 gでした（71.4％減少；図4b）。 全生存率はカプラン・マイヤー法によって推定され、モグロシド V 治療と生存との関連が確認されました (生存曲線については図 4c を参照)。 私たちのデータは、モグロシド V が in vivo 膵臓がんモデルに使用されたマウスの生存を延長できるだけでなく、in vivo 結腸がん HT29 および喉頭がん HEP-2 異種移植モデルに使用されたマウスの生存も延長できることを実証しました (補足図 S1)。 これらの異種移植実験の結果は、図 1b に示す in vitro データと一致しており、モグロシド V が強力な腫瘍増殖阻害剤である可能性があることが示されました。

モグロシド V は、マウス異種移植腫瘍モデルにおける PANC-1 細胞腫瘍の増殖を阻害します。 マウスにPANC-1細胞を移植し、無作為に5つのグループに分けた：対照群、NC（生理食塩水）、および2、10、または30 mg/kg体重kgモグロシドVを週3回投与する3つの治療群。 (a) マウスを屠殺し、治療後 35 日目に腫瘍を解剖した後にノギスで測定した、5 つのグループの腫瘍異種移植片の平均体積。 (b) 5 つのグループの腫瘍異種移植片の平均重量。 腫瘍重量は、モグロシド V 治療群の方が対照群および NC 群よりも有意に低かった。 統計分析のために、スチューデントの t 検定を使用して、モグロシド V 治療マウスをビヒクル対照マウスと比較しました。 **P<0.01 および ***P<0.001 対対照値。 （ c ）カプランマイヤー生存分析は、モグロシドV治療が全生存期間と有意に相関していることを示しました（P <0.01、ログランク検定を使用、P <0.05は有意であるとみなされます）。

インビボでのモグロシド V による腫瘍増殖阻害の根底にある潜在的なメカニズムを、細胞死、細胞増殖、および血管新生を検出する IHC アッセイで評価しました。 組織切片の TUNEL 染色 (図 5) により、低用量 (57.8% TUNEL 陽性)、中用量 (73.1% TUNEL 陽性)、および高用量 (82.1% TUNEL 陽性) でより多くの細胞が TUNEL 陽性であることが明らかになりました。モグロシド V 群を対照群 (5.2% TUNEL 陽性) の細胞と比較したことは、モグロシド V が PANC-1 腫瘍細胞において高率のアポトーシスを誘導したことを示しています。

PANC-1 細胞異種移植腫瘍のアポトーシスの免疫組織化学的分析。 TUNEL法を使用して細胞を染色し、ビヒクル対照と比較することによってアポトーシスをスコア化した。 左側の画像は、対照群およびモグロシド V 治療群の腫瘍を構成する PANC-1 細胞における TUNEL 染色のレベルを示しています。 右側のグラフは、8 つの独立した腫瘍からの組織切片を計数することによって決定された、TUNEL 染色のモグロシド V 濃度依存性の増加を示しています。 統計分析のために、スチューデントの t 検定を使用して、モグロシド V 治療マウスをビヒクル対照マウスと比較しました。 ***P<0.001 対対照値。

次に、IHC を使用して PCNA と Ki-67 を検出し、腫瘍内の細胞増殖を評価しました。 これらのマーカーを発現する細胞の数は、対照群と比較してすべてのモグロシド V 治療群で有意に減少しました (P<0.001) (図 6)。 インビボでの PCNA および Ki-67 mRNA 発現は、リアルタイム PCR (RT-PCR) アッセイによって評価されました (図 6)。 モグロシド V は明らかに PCNA および Ki-67 mRNA 発現を減少させ、これは図 6 に示す IHC データと一致していました (P<0.001)。 総合すると、これらのデータは、モグロシド V が腫瘍細胞の生存と増殖を阻害することを示しました。

PANC-1異種移植腫瘍におけるPCNAおよびKi-67の発現に対するモグロシドVの効果。 （ a ）モグロシドVがPCNA発現を阻害することを示す免疫組織化学染色とRT-PCR分析の画像。 （ b ）モグロシド V が PCNA 発現を阻害したことを示す免疫組織化学染色および RT-PCR 分析の画像。 データは平均値±標準偏差を表します。統計分析はスチューデントの t 検定を使用して実行されました。 ***P<0.001 対対照値。

最後に、モグロシド V が腫瘍の微小血管密度 (MVD) と血管新生に影響を与えるかどうかを確認しました。 図7aに示すように、血管新生促進因子である血管内皮増殖因子（VEGF）の発現は、モグロシドV治療群（最高用量群では細胞の22.82％がVEGF+であった）では対照群（64.71％）よりも低かった。細胞の % が陽性でした; P<0.001); したがって、最高用量のモグロシド V での治療後には、VEGF 発現細胞が 64.73% 減少しました。 腫瘍における MVD に対するモグロシド V 治療の効果を調べるために、血管を CD31 で標識し (図 7b)、以下に従って MVD を計算しました。ワイドナーの方法に。 モグロシド V 治療群の MVD 値 (図 7c) (4.11) は、対照群の値 (37.23; 88.96% 減少、P<0.001) よりも有意に低かった。 これらの結果は、モグロシド V が用量依存的に腫瘍血管新生を阻害することを示しました。

VEGFおよびCD31発現の免疫組織化学的分析による血管新生の決定。 PANC-1 腫瘍では、VEGF および CD31 タンパク質の発現が大幅に下方制御されていました。 (a) 示された対照群およびモグロシド V 治療群のそれぞれの異種移植片腫瘍における VEGF の免疫組織化学的染色。 (b) 示された対照群およびモグロシド V 治療群のそれぞれの異種移植腫瘍における CD31 免疫組織化学的染色の代表的な画像。 (c) CD31 発現によって決定された異種移植片腫瘍の切片における MVD 測定のグラフ。 データは平均値±標準偏差を表します。統計分析はスチューデントの t 検定を使用して実行されました。 *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001 対対照値。

この研究では、細胞および分子のアプローチを使用して、モグロシド V による細胞分裂と PANC-1 腫瘍生存制御の根底にあるメカニズムを解明しました。我々の発見は、モグロシド V 治療が腫瘍細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、腫瘍退縮を引き起こすことを明確に示しました。 さらに、モグロシド V は膵臓がん細胞だけでなく、U937 がん細胞や A549 がん細胞の増殖も抑制しました。 対照的に、同等の濃度のモグロシド V は、正常なヒト肝細胞 (L02) に対して最小限の影響を及ぼしました (図 1b)。 総合すると、これらの結果は、モグロシド V は癌細胞よりも正常細胞に対して毒性が低い可能性があることを示唆しています。

これまで、モグロシド V の生化学的標的は解明されていませんでした。 ここでは、ウェスタンブロッティングを使用して、モグロシド V が STAT3 のタンパク質発現を調節することを実証しました。 さらに、モグロシド V は、細胞増殖を促進する STAT3 経路の下流標的 (CCND1、CCNE1、および CDK2) を阻害すると同時に、細胞周期阻害剤 (CDKN1A および CDKN1B) を上方制御しました。 これらの効果は、モグロシド V で処理した PANC-1 細胞における用量依存的な G0-G1 細胞周期停止に関する我々の発見と一致しています。 17 さらに、我々は、モグロシド V 処理が STAT3 (たとえば、BCL2) の下流の抗アポトーシスシグナルを阻害することを発見しました。これは、アポトーシス促進タンパク質 CASP3 および BAX の発現の増加と一致しました。20、21 さらに、PANC-1 細胞のアポトーシスがカスパーゼ阻害剤 z-VAD-fmk によって部分的にブロックされることも発見しました（図2c)、モグロシド V 誘導性アポトーシスが部分的にカスパーゼ経路を介して媒介される可能性があることを示唆しています。

PANC-1 異種移植モデルを使用して得られた我々の結果は、モグロシド V が in vivo での腫瘍増殖を強力に阻害することを示しました。 さらに、我々の in vitro での所見と同様に、モグロシド V は in vivo での細胞生存率と増殖も低下させ、PANC-1 腫瘍における p-STAT3 を用量依存的に低下させた（補足図 S2）。 TUNEL アッセイにより、モグロシド V がアポトーシスを強力に誘導することが明らかになりました。 異種移植腫瘍における増殖活性は、Ki-67 および PCNA について IHC によって評価されました。 Ki-67 は、G0 期を除く細胞周期のすべての期で発現する細胞増殖マーカーです 22, 23 PCNA、腫瘍細胞および非腫瘍細胞の増殖に関与する 36 kD DNA ポリメラーゼ デルタ補助タンパク質、 24、25 は増殖細胞核で特異的に発現され、腫瘍細胞の増殖を測定するために一般的に使用されます。 Ki-67 と PCNA の両方の発現は、対照群と比較して、すべてのモグロシド V 治療群の PANC-1 異種移植腫瘍で減少しており、腫瘍重量の減少と一致していました。 したがって、モグロシド V は、PANC-1 細胞の増殖を阻害することによって薬理学的に作用すると同時に、アポトーシスも誘導し、それによってその後の膵臓腫瘍の増殖を制限する可能性があります。

最後に、PANC-1異種移植腫瘍ではVEGF発現とMVDが減少していることを発見しました。 VEGF は、腫瘍と健康な組織の両方で血管新生に重要な役割を果たしています 26, 27。 したがって、これらのデータは、モグロシド V が VEGF 依存性のメカニズムを通じて血管新生を阻害することにより、膵臓腫瘍の増殖を防止する可能性があることを示唆しています。 結果として、これは MVD の減少につながり、したがって腫瘍増殖の減少につながります。 STAT3は、VEGFプロモーターに直接結合することでVEGF転写の必須メディエーターであり、それによって血管新生を誘導します28,29。私たちの研究では、モグロシドVが、生体内でのVEGFタンパク質レベルの低下と同時に、PANC-1がん細胞におけるSTAT3タンパク質の活性化を有意に阻害することが示されました。 。 この発見は、モグロシド V の抗血管新生効果が STAT3 活性化を防ぐモグロシド V の能力によるものである可能性を示唆しています。

我々の研究は、腫瘍異種移植片として使用されたPANC-1細胞におけるSTAT3の安定した過剰発現またはSTAT3の欠失の影響を調査しなかったという事実によって限界があった。 これらの条件下でのモグロシド V 治療の有効性は不明であり、今後の研究の焦点となります。

結論として、我々は、インビトロおよびインビボ実験を通じて、モグロシド V が膵臓がん細胞の増殖を阻害し、腫瘍のアポトーシスを促進することを発見しました。 さらに、モグロシド V は膵臓腫瘍における血管新生を妨げました。 したがって、我々の結果は、モグロシド V が STAT3 経路に作用する潜在的な抗がん化合物である可能性を示唆しています。 さらに、モグロシド V が in vivo で腫瘍の進行を防ぐだけでなく、マウスの生存率を高めることも実証しました。これは、この天然化合物が潜在的な治療活性を持っている可能性があることを示しています。 モグロシド V は米国食品医薬品局によって承認された天然甘味料であるため、膵臓がんの予防または治療のために食品および飲料の添加物として日常消費に使用される可能性があります。

モグロシド V は Sigma-Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス) から購入しました。 他のすべての試薬も、特に指定がない限り、Sigma-Aldrich から購入しました。

ヒト膵臓腺癌細胞株 PANC-1 は、上海細胞生物学研究所 (中国、上海) から入手しました。 PANC-1細胞は、10％熱不活化ウシ胎児血清（Gibco、米国ニューヨーク州グランドアイランド）、100μg/mlストレプトマイシンおよび100U/mlペニシリンを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で、加湿5％CO2雰囲気下で培養した。 37℃で。 ヒト膵臓腺癌細胞株 MiaPaCa-2 および CFPAC-1、A549 肺腺癌、ヒト U937 および L02 正常ヒト肝細胞は、Shanghai Cell Biology Institute から入手しました。 MiaPaCa-2 細胞と CFPAC-1 細胞はダルベッコ改変イーグル培地で培養し、A549、U937、および L02 細胞は RPMI1640 で培養しました。 すべての培地には、熱不活化ウシ胎児血清（10％）、100μg/mlストレプトマイシンおよび100U/mlペニシリンを補充した。 細胞は 37 °C、5% CO2 で維持されました。

細胞を 1 × 104 細胞/ml の初期濃度で 96 ウェル細胞培養プレートに添加し、示された濃度のモグロシド V とともにインキュベートしました。 24 時間または 72 時間のインキュベーション後、MTT 溶液 (5 mg/ml) を添加しました。ウェルに移し、細胞をさらに 4 時間インキュベートしました。 増殖培地を除去し、ELISA リーダーを使用して 490 nm での吸光度を測定することにより、MTT 色素の酸化によって形成されたホルマザン結晶を分析しました。30、31

In Situ Cell Death Detection Kit (POD; Roche Applied Science、米国インディアナ州インディアナポリス) を使用した TUNEL 反応によって細胞をアポトーシス DNA 鎖切断について標識し、モグロシド V 誘導性アポトーシスを起こしている細胞の割合を決定し、 DAB基質を使用して30分間抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼ。 アポトーシス細胞は、光学顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を使用して視覚化されました。 アポトーシス細胞を定量化するために、300 個の細胞からなる癌細胞集団における TUNEL 陽性細胞のパーセンテージを、ガラス スライドあたり 5 つのランダムなフィールドで測定しました。

細胞周期の状態はフローサイトメトリーを使用して決定されました。 PANC-1 細胞は、モグロシド V で 24 時間処理した後の細胞周期の変化について分析されました。 フローサイトメトリー実験に使用した細胞は、浮遊細胞と付着細胞の両方でした。 細胞を 70% メタノールで固定した後、RNase A で処理し、フローサイトメトリー分析のためにヨウ化プロピジウムに曝露しました。 アポトーシスの検出は、アネキシン V アッセイキット (アネキシン V-FITC アポトーシス検出キット; BD Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用したアネキシン V-FITC 染色を使用して実行されました。 簡単に説明すると、PANC-1 細胞 (1 × 105 細胞) をモグロシド V とともに 24 ～ 96 時間培養した後、製造元の指示に従ってアネキシン V-FITC およびヨウ化プロピジウムで標識しました。 コントロール細胞およびモグロシド V 処理細胞でアポトーシスを起こしている細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析しました。 アポトーシス阻害アッセイでは、細胞をモグロシド V の存在下または非存在下で、アポトーシス阻害剤 zVAD (20 μmol/l) の存在下または非存在下で 48 時間インキュベートしました。 結果は、CellQuest ソフトウェア (BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) で評価されました。

細胞をモグロシド V で 24 時間処理し、溶解バッファー (0.05 M Tris-HCl、pH 7.4、1% Triton X-100、0.1 M NaCl、1% デオキシコール酸ナトリウムおよび 0.1% SDS) 中で 4 °C で溶解しました。 1 mM フェニルメタンスルホニルフルオリドおよびプロテアーゼ阻害剤。 不溶性タンパク質溶解物を遠心分離により除去した。 細胞溶解物からの約 15 μg のタンパク質を 12% SDS-PAGE で分離し、その後ポリフッ化ビニリデン膜に転写しました。 ウェスタンブロット分析には次の一次抗体を使用しました:STAT3 (1:1000 希釈)、ホスホ-(p)-STAT3、CDKN1A、CDKN1B (p27)、BCL2、および β-アクチン (すべて Sigma-Aldrich 製)。 適切な二次抗体 (すべて Sigma-Aldrich 製) とインキュベートした後、メンブレンを ECL plus (ECL、Amersham Biosciences、GE Healthcare、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国) で現像しました。 タンパク質バンドの濃度測定は、GS-800 イメージング濃度計 (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用して実行されました。

膵臓腫瘍の in vivo 特性を BALB/c ヌードマウス異種移植モデルで調査しました。 Vital River (Charles River Ltd. Co.、北京、中国) から入手した約 8 週齢の雄ヌード BALB/c マウスを、病原体のない環境で維持しました。 異種移植腫瘍モデルを確立するために、PANC-1 細胞 (1 × 107) をマウスの脇腹に皮下注射しました。 マウスを以下の 5 つのグループにランダムに分けました：（i）未治療の対照グループ、（ii）NC グループ（生理食塩水）、（iii）2 mg/kg 体重のモグロシド V グループ、（iv）10 mg/kg 体重のモグロシド VモグロシドＶを生理食塩水に溶解し、０．１ｍｌの量でマウスに投与した。 腫瘍は 3 日ごとにノギスで測定されました。 腫瘍体積は、腫瘍の長さ (l) と幅 (w) を測定し、腫瘍体積 (V=w2l/2) を計算することによって決定されました。32 5 週間後、マウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、重さを量った。 腫瘍増殖の阻害率は、次の式を使用して計算されました：腫瘍増殖阻害率（％）=（1-MT/MC）×100、ここでMTとMCはそれぞれ治療群と対照群の平均腫瘍質量です。 動物の使用は北京農業大学の動物福祉ガイドラインに準拠しました。

解剖後、腫瘍組織を直ちに 10% リン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋しました。 膵臓がん細胞の増殖は、マウスモノクローナル PCNA または Ki-67 抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.、Santa Cruz、CA、USA) のいずれかを用いた IHC 染色、および PCNA および Ki-67 陽性細胞の数によって推定されました。 200 個の細胞からなる集団を 400 倍の倍率でサンプリングして計数しました。 その後、増殖細胞の核抗原標識指数と Ki-67 標識指数を計算しました。 モグロシド V による治療後、CD31 および VEGF で免疫染色した組織切片で血管新生を評価しました。 MVD は Weidner の方法に従って計算されました 33、34。TUNEL 免疫組織化学は、In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ) を製造業者の指示に従って使用して実施しました。

目的の mRNA 転写物の発現レベルは、RT-PCR アッセイによって決定されました 35。総 RNA は、TRIzol 試薬 (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) を使用して新鮮な腫瘍組織から単離されました。 オリゴ(dT)プライミングRNA(2μg)を、製造業者の指示に従って、SuperScript II逆転写酵素(Promega、米国ウィスコンシン州マディソン)を用いて逆転写した。 得られた cDNA を使用して、Taq DNA ポリメラーゼ (Fermentas、Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を用いた PCR によって PCNA および Ki-67 の mRNA 量を決定しました。 GAPDHを内部対照として使用した。 PCNA、Ki-67、および GAPDH の増幅には次のプライマー配列を使用しました:PCNA フォワード 5'-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3' およびリバース 5'-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3' (Tm = 60 °C、109 bp)。 Ki-67 順方向 5'-GCCTGCTCGACCCTACAGA-3' および逆方向 5'-GCTTGTCAACTGCGGTTGC-3' (Tm=60 °C、127 bp)。 GAPDH 順方向 5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3' および逆方向 5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3' (Tm=60 °C、101 bp)。 得られたPCRサンプルをゲル電気泳動(1.5%アガロース)によって分析した。 DNA バンドは、Gel Documentation System (Model Gel Doc 2000; Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用して検査しました。

データは、インビトロ研究については３回の独立した実験の平均値±標準偏差として、インビボ研究についてはｎ＝６として表した。 統計的有意性は、スチューデントの t 検定を使用して決定されました。 生存率はカプラン・マイヤー法を使用して推定され、得られた値はログランク検定を使用して比較されました。 統計分析は、GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して実行され、P<0.05 が統計的に有意であるとみなされました。

この記事は撤回されました。 詳細については、撤回通知をご覧ください: https://doi.org/10.1038/s41389-023-00461-7

この論文の正誤表が公開されました: https://doi.org/10.1038/oncsis.2017.19

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北京農業大学財団（No.2017516005; No.1086716276）からのご支援に感謝いたします。

C Liu と LH Dai: これらの著者は、この研究に等しく貢献しました。

中国、北京市、北京農業大学農業部都市農業重点実験室（北）

C Liu、DQ Dou、LQ Ma

中国科学院、天津産業バイオテクノロジー研究所、産業酵素国立工学研究所、中国天津

C Liu、LH Dai、YX Sun

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DQ堂またはLQ馬に対応。

著者は利益相反がないことを宣言します。

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Liu、C.、Dai、LH.、Dou、DQ. 他。 撤回された論文: 抗膵臓がん特性を持つ天然食品甘味料。 腫瘍形成 5、e217 (2016)。 https://doi.org/10.1038/oncsis.2016.28

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受信日: 2015 年 10 月 30 日

改訂日: 2016 年 2 月 12 日

受理日: 2016 年 3 月 7 日

公開日: 2016 年 4 月 11 日

発行日：2016年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/oncsis.2016.28

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