ニュース

Aug 06, 2023

発芽段階での in vitro スクリーニングによる EMS 変異誘発アルファルファ (Medicago sativa L.) 変異体の乾燥耐性の改善

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12693 (2022) この記事を引用

2065 アクセス

メトリクスの詳細

この研究の目的は、35% PEG6000 の浸透圧ストレスの存在下で発芽段階で EMS 変異誘発 340675 M3 種子をスクリーニングすることにより、アルファルファ (Medicago sativa L.) の乾燥耐性の新規変異株の遺伝子型を決定することでした。 根の成長アッセイにより、いくつかの乾燥耐性候補変異体が得られました。 それらのうち、4 つの変異体は、開花芽段階での最初の挿し木後 24 日間適用された水分欠乏条件でさらに評価されました。 その結果、発芽段階で乾燥耐性があると判定された変異体は、水分欠乏条件にも耐性があることが明らかになった。 タンパク質含有量とスーパーオキシドジスムターゼ値は、すべての変異体で対照よりも高いことが判明しました。 アスコルビン酸過酸化物、グルトンレダクターゼ、および脂質ペルオキシダーゼの値は、変異体の遺伝子型と干ばつストレスの期間に基づいて変化しました。 干ばつストレスは、MtP5CS、MtDehyd、MseIF-2、MtRD2、および MsNAC 遺伝子の転写レベルを大きく変化させました。 これらの結果は、発芽および苗の成長初期段階における浸透圧耐性についてのアルファルファ変異体種子のインビトロスクリーニングが、開花芽段階での最初の挿し木後の水分欠乏条件にも耐性である乾燥耐性アルファルファ変異体を首尾よく決定できたことを示した。

地球温暖化により、植物の生産に必要な灌漑用水が制限され、今日の農業生産が脅かされています1。 したがって、干ばつストレス条件への耐性を高め、収量損失を最小限に抑えることができる新しい植物品種の開発は、将来世代の食糧安全保障を確保するという観点から戦略的に重要です。 しかし、干ばつストレス機構の複雑な構造は、育種研究の進展が遅い最も重要な理由の 1 つです2。 干ばつ耐性は、いくつかの遺伝子によって制御される量的遺伝を示します3。 これらの遺伝子間のエピスタティックな関係と多面的な関係もまた、育種研究の実践を非常に困難にしています3。 さらに、植物の発育期間、ストレスの継続期間、重症度などの要因も、乾燥ストレスの量的遺伝の程度を評価するための重要な決定要因となります4。

干ばつ耐性のある植物は、水ポテンシャルが低い条件でも通常の機能を実行する能力を持っています5。 植物は水不足条件下でいくつかの戦略を使用して、生理学的、形態学的、および転写レベルでの乾燥ストレスの悪影響を最小限に抑えます。 植物はまた、干ばつ条件下で高い水ポテンシャルを維持する植物の能力として定義される逃避戦略を使用します。 この戦略は一般に、葉面積の減少、気孔の数と導電性の減少、密な根系の形成、根と茎の比率の増加など、植物の農業形態学的変化によって提供されます6。

アルファルファ（Medicago sativa L.）は必須の飼料作物であり、高い干し草収量、卓越した栄養品質、窒素固定能力8など、さまざまな方法で持続可能な農業と畜産業に貴重な貢献をしているため、世界中で経済的に重要な重要性を持っています8。 アルファルファ種内で栽培されている品種は、ほぼ同一のゲノムを持つ自動四倍体です9。 アルファルファは根が深く根を張っているため、一般に乾燥耐性が強いとされていますが、これは一般に植え付け後数年間で顕著になります10。 しかし、発芽と苗の初期の成長に加えて、植え付け年の挿し木直後のアルファルファの再成長段階は、乾燥ストレスに対して非常に脆弱です。 さらに、アルファルファは数回収穫され、成長期に最も収量の高い飼料を供給するため、特に乾燥地域では、他の栽培植物と比べてはるかに多くの灌漑水を必要とします。

干ばつなどのさまざまな非生物的ストレスに耐えるアルファルファの新品種の開発は部分的には成功していますが11、他の重要な作物種に比べて進歩は非常に限られています12。 さらに、直接選抜による乾燥ストレスに対する耐性植物の同定は、主に、使用される材料の遺伝的変異とスクリーニング法の成功の両方に依存します。 交配法を使用し、既存のアルファルファの狭い遺伝的基盤をスクリーニングすることによって、新しい乾燥耐性アルファルファ遺伝子型を開発することは、非常に困難であると思われる13。 したがって、我々はエチル メタン スルホネート (EMS) 突然変異誘発を使用して、新しい遺伝的変異を作成しました。 インビトロ条件下で発芽段階で M3 変異種子をスクリーニングすると、いくつかの乾燥耐性候補が得られました。 そのうちの 4 つについては、花芽段階での最初の挿し木から 24 日間適用された水分欠乏条件下で、生理学的、形態学的、および転写レベルでも再評価されました。灌漑ありと非灌漑の生育条件。 突然変異体の干ばつストレス応答を、灌漑した対照植物と灌漑していない対照植物と比較した。

35% PEG6000 の浸透圧ストレスの存在下で発芽および苗の成長初期段階で 340675 個の M3 種子をスクリーニングしたところ、いくつかの乾燥耐性候補が得られました (図 1)。 それらのうち、4 つの変異体について、開花芽段階での最初の挿し木後 24 日間適用された水分欠乏条件下での再成長性能についてさらにテストし、結果を灌漑した (Z1) および灌漑していない対照植物 (Z2) の両方と比較しました (表 1) ）。

変異型M3種子と発育苗のスクリーニング。 (A) 35% PEG6000 を含む MS 培地に植えられた種子の拡大図。 (B) *、非変異対照種子。 **、変異型 M3 種子。 (C – D) スクリーニングからの候補変異体実生。 矢印は幼根の伸長を示します。 (E – F) MS 培地から苗を救出し、ヴィオールに植えました。 (G–H) プラスチックポットに植えられた苗と開花芽の段階で成長した植物。

農業形態学的パラメーターの結果は、M3 変異体内の重要な変動だけでなく、対照植物と比較して有意な差異も示した (表 1)。 乾燥ストレスの18日目における変異体の草丈は36.3cmから45.7cmの範囲であったが、Z1およびZ2対照の草丈はそれぞれ42.1cmおよび38cmであった(表1)。 乾燥ストレスを 24 日間延長すると、1 つを除くすべての変異体 (変異体 Y20) の草丈が対照 Z2 (52.0 cm) よりも長くなりました。 変異体 Y20 と対照 Z2 を除いて、乾燥ストレスが 18 日から 24 日まで続いたため、主茎は全体的に太くなりました (表 1)。 突然変異体の自然草丈に対する干ばつストレスの影響は、干ばつの期間に応じて変化した。 側枝の数は、乾燥ストレスの 18 日目と 24 日目では、植物あたりそれぞれ 2 ～ 9 および 4 ～ 11 の範囲でした。 変異体 Y20 を除いて、乾燥ストレスの期間により、すべての変異体および対照植物において側枝の数が増加しました (表 1)。 乾燥ストレスが 18 日から 24 日まで延長された場合、植物あたりの葉の数は対照および変異体 X6 植物で増加しましたが、変異体 Y20、Y25、および Y35 では植物あたりの葉の数が減少したことが測定されました (表 1)。 乾燥ストレスは、乾燥ストレスの18日目と24日目に、すべての変異体および対照において中央小葉の長さと幅を減少させた(表1)。 しかし、変異体の減少率は対照の Z2 植物よりも小さかった (表 1)。 乾燥ストレスを受けた18日と24日の植物の樹冠温度は、対照と変異体の間で大きく異なることが判明した(表1)。 変異体 Y20 および Y30 は、乾燥ストレス 18 日目には両方の対照より樹冠温度が低く、一方、乾燥ストレス 24 日目には変異体 Y20 の樹冠温度が他の変異体より有意に低かった (表 1)。 変異体 X6 からは、さやあたりの種子数が最も多く (さやあたり 2 種子)、植物あたりの種子収量が最も多かった (1.34 g/植物) が得られましたが、変異体 Y35 では種子が得られませんでした (表 1)。 変異体の花の色はピンクから紫まで変化しましたが、対照の花の色はピンクのみでした(表1)。

干ばつストレスにより、アルファルファのタンパク質含有量が大幅に減少しました（p < 0.001）（図 2A）。 しかし、変異体 Y20 および Y30 の全体的なタンパク質含有量は両方の対照 (Z1 および Z2) 植物よりも高いことが判明しましたが、変異体 X6 および Y35 のタンパク質含有量は灌漑対照 (Z1) と同レベルでした (図 2B)。 変異体の中で、変異体 Y20 は全体のタンパク質含量が最も高く (100.68 mg/ml)、変異体 Y35 はすべての時間間隔を考慮して最も低かった (66.04 mg/ml) (図 2B)。 変異体 Y20 のタンパク質レベルは、乾燥ストレスが続くにつれて大幅に増加しましたが、変異体 Y30 では試験したすべての時間間隔で安定でした (図 2C)。 最も高いタンパク質レベル（104.9 mg/ml および 118.60 mg/ml）は変異体 Y20 から得られましたが、対照 Z2 は乾燥ストレスの 18 日目と 24 日目にそれぞれ 25.30 mg/ml と 35.75 mg/ml でした（図 2C）。 ）。

タンパク質の含有量。 (A) 所定の時間間隔での変異体および対照植物に対する乾燥ストレスの全体的な影響、n = 18。(B) 変異体および対照植物の全体的なタンパク質含量、n = 9。(C) 変異体のタンパク質含量に対する干ばつストレスの影響。所定の時間間隔での対照プラントとの比較。エラーバーは標準偏差、n = 3 を示します。異なる文字は、P < 0.05 での有意差を示します。 大文字、小文字、または小さな斜体文字は、特定の時間間隔で実行される統計分析を示します。

干ばつストレスはSODアイソザイムレベルを有意に低下させ(図3A)、変異体Y35は最も高いSODレベル(1.54U/mgタンパク質)を有していた(図3B)。 18日間の干ばつストレスにより、対照植物と変異体X6植物の両方でSODレベルが有意に増加しましたが、他の変異体ではSODレベルが挿し木段階前に観察されたレベルまで有意に減少しました（図3C）。 対照および変異体X6とは対照的に、変異体では乾燥ストレスの24日目にSOD酵素レベルが著しく上昇した(図3C)。

スーパーオキシドジスムターゼ (SOD) アイソザイムレベル。 (A) 所定の時間間隔での変異体および対照植物に対する乾燥ストレスの全体的な影響、n = 18。(B) 変異体および対照植物の全体的な SOD レベル、n = 9。(C) 変異体の SOD レベルに対する乾燥ストレスの影響。所定の時間間隔での対照プラントとの比較。エラーバーは標準偏差、n = 3 を示します。異なる文字は、P < 0.05 での有意差を示します。 大文字、小文字、または小さな斜体文字は、特定の時間間隔で実行される統計分析を示します。

干ばつストレスの最初の期間（18日間）ではTBARSレベルが減少しましたが（図4A）、切断前と乾燥ストレスの24日目の期間の間には有意差は検出されませんでした（図4A）。 最も高いTBARSレベル(3.80および3.36nmol/gタンパク質)は、それぞれ変異体Y20およびX6から得られたが、変異体Y35は最も低かった(1.83nmol/gタンパク質)(図4B)。 変異体Y35は、乾燥ストレスが18日から24日まで続くにつれてTBARSレベルを増加させたが、変異体Y30はそれを減少させた(図4C)。 一般に、切断段階前のTBARSレベルと比較して、乾燥ストレスの所定の時間間隔で、対照および変異体Y20およびX6で同様のパターンのTBARSレベルが検出された（図4C）。

チオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) レベル。 (A) 所定の時間間隔での変異体および対照植物に対する乾燥ストレスの全体的な影響、n = 18。(B) 変異体および対照植物の全体的な TBARS レベル、n = 9。(C) 変異体の TBARS レベルに対する乾燥ストレスの影響。所定の時間間隔での対照プラントとの比較。エラーバーは標準偏差、n = 3 を示します。異なる文字は、P < 0.05 での有意差を示します。 大文字、小文字、または小さな斜体文字は、特定の時間間隔で実行される統計分析を示します。

最も高いAPX酵素活性（0.17 U/mgタンパク質）は、試験した他の時間間隔と比較して、乾燥ストレスの18日目に測定されました（図5A）。 APX活性は対照Z2で最も高かった(0.19U/mgタンパク質)が、全体の期間を考慮した変異体Y35(0.148U/mgタンパク質)と対照Z1(0.130U/mgタンパク質)の間に有意差は検出されなかった(図５Ｂ）。 変異体 Y35 は、他の変異体と比較して全体的な APX レベルが最も高かった (図 5B)。 APX活性は変異体Y35で最も高かったが、切断前の時点では両方の対照のAPX活性が最も低かった(図5C)。 APX 酵素活性は、干ばつストレスの 18 日目に対照および変異体 X6 で切断前に測定されたレベルと比較して有意に増加しましたが、統計的に同じ APX 酵素活性レベルが灌漑対照 (Z1) と変異体では 18 日目に測定されました。干ばつストレス (図 5C)。 変異体 Y35 を除いて、変異体 Y35 は両方の対照と同じレベルの APX 酵素活性を有していましたが、乾燥ストレスの 18 日目と比較して、乾燥ストレスの 24 日目では対照植物と変異体植物で APX 酵素活性レベルの低下が測定されました (図.5C）。

アスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APX) 酵素活性。 (A) 所定の時間間隔での変異体および対照植物に対する乾燥ストレスの全体的な影響、n = 18。(B) 変異体および対照植物の全体的な APX レベル、n = 9。(C) 変異体の APX レベルに対する乾燥ストレスの影響。所定の時間間隔での対照プラントとの比較。エラーバーは標準偏差、n = 3 を示します。異なる文字は、P < 0.05 での有意差を示します。 大文字、小文字、または小さな斜体文字は、特定の時間間隔で実行される統計分析を示します。

GR レベルは、切断前と比較して、乾燥ストレス中に大幅に増加しました (図 6A)。 乾燥ストレスの終了時に大幅な減少が観察されましたが、全体的な GR レベルは伐採段階前よりも大幅に高かった (図 6A)。 最高の全体的な GR レベル (0.098 (U/mg タンパク質) は対照 Z2 から得られましたが、変異体と対照 Z1 では有意差は確認されませんでした (図 6B)。対照植物と変異体植物の GR レベルで有意差が確認されました)与えられたすべての期間で（図 6C）、灌水対照（Z1）は切断前の段階で最も低い GR レベルを示しましたが、対照 Z2 と変異体では統計的に同じ GR レベルが測定されました（図 6C）。干ばつストレスにより、対照植物と変異体植物（変異体 Y35 を除く）の両方で GR レベルが大幅に増加しましたが、変異体では対照植物よりも GR 量が比較的低かった（図 6C）。変異体 X6 を除き、変異体は 24 日に GR レベルの増加を示しました。乾燥ストレスの 18 日目と比較して対照植物では GR 含有量の減少が測定されましたが (図 6C)、同様のパターンの GR 含有量が、所定の期間で変異体 X6 と対照植物で測定されました (図 6C)。 6C）。

グルタチオンレダクターゼ (GR) 酵素活性。 (A) 所定の時間間隔での変異体および対照植物に対する乾燥ストレスの全体的な影響、n = 18。(B) 変異体および対照植物の全体的な GR レベル、n = 9。(C) 変異体の GR レベルに対する乾燥ストレスの影響。所定の時間間隔での対照プラントとの比較。エラーバーは標準偏差、n = 3 を示します。異なる文字は、P < 0.05 での有意差を示します。 大文字、小文字、または小さな斜体文字は、特定の時間間隔で実行される統計分析を示します。

MtP5CS 遺伝子発現は大きな変動を示し、乾燥ストレス 18 日目には発現レベルが 0.03 (変異体 Y30) と 1.14 倍 (X6) に低下したが、乾燥ストレスの 18 日目には 0.31 倍 (X6) から 4.71 倍 (Y30) に増加した。干ばつストレスの 24 日目 (図 7A)。 一方、乾燥ストレスが18日から24日に延長されると、対照Z2ではMtP5CS遺伝子の発現レベルが18.6倍から0.9倍に減少したが、対照Z1では同じ遺伝子の発現レベルが3.49倍から0.9倍に増加した。同じ時間間隔で 21.75 倍になります (図 7A)。 変異体X6を除いて、乾燥ストレスに応答して変異体でも同様の発現パターンが観察されたが、対照Z1は乾燥ストレスが18日から24日続くにつれてMtP5CS遺伝子発現の上昇を示した（図7A）。

一定の時間間隔での乾燥応答性遺伝子の相対発現レベル (A ～ E) MtP5CS (Medicago truncatula ピロリン-5-カルボン酸シンテターゼ) (A)、MtDehyd (Medicago truncatula デヒドリン) (B)、MseIF-2 (Medicago) の発現の変化アルファルファ変異体植物の葉組織における sativa 真核生物翻訳開始因子 2) (C)、MtRD2 (Medicago truncatula Response to Desiccation 2) (D)、および MsNAC (Medicago sativa NAC; NAM、ATAF、および CUC2) (E) 遺伝子。 Ms18s rRNA (18S リボソーム RNA) を参照遺伝子として使用しました。 示された結果は、平均値 ± 標準誤差、n = 3 です。異なる文字は、P < 0.05 での有意差を示します。

LEA（後期胚形成豊富）遺伝子としても知られるMtDehydの制御は、芽の段階での最初の切断後に加えられた乾燥ストレスに応答して大きな変化を示し、関連遺伝子の制御レベルは遺伝子型に依存していることが判明しました（図7B）。 。 乾燥ストレスの18日目におけるMtDehyd遺伝子の発現は、参照遺伝子と比較して0.07倍(X6)から3.12倍(Y20)まで変化した(図7B)。 MtDehyd 遺伝子発現は、乾燥ストレスの 18 日目に変異体 X6、Y35 および対照 Z2 植物で有意に減少しましたが、変異体 Y20、Y230 および対照 Z1 植物では同じ時間間隔で同じ遺伝子の発現レベルの増加が観察されました。切断段階の前（図7B）。 乾燥ストレスが18日から24日まで延長された場合、MtDehyd遺伝子発現は、対照Z1(2.42倍から39.23倍)および変異体X6(0.07倍から0.45倍)で上方制御された(図7B)。

MseIF-2遺伝子発現の調節は、変異体の遺伝子型および乾燥ストレスの期間に応じて変化した(図7C)。 たとえば、変異体 Y20、Y30、および Y35 は、乾燥ストレスの 18 日目に 1.26 倍、1.97 倍、および 1.71 倍の増加を示しましたが、18 日目には 0.38 倍、0.04 倍、および 0.25 倍の変化に大幅に減少しました。それぞれ、干ばつストレスの24日目（図7C）。 一方、変異体X6のMseIF-2遺伝子発現は、切断前と比較して、乾燥ストレス18日目に低下し、乾燥ストレス24日目に増加した（図7C）。 乾燥ストレスが18日から24日まで延長されると、MseIF-2遺伝子の発現レベルは両方の対照植物（Z1およびZ2）で有意に上昇したが、変異体X6を除く変異体では有意な減少が観察された（図7C）。

乾燥ストレスの期間を18日から24日まで延長すると、変異体Y20、Y30、およびY35ではMtRD2遺伝子の発現レベルが大幅に低下しましたが、対照植物（Z1およびZ2）では両方の植物で大幅な増加が生じました（図7D）。 ＭｔＲＤ２遺伝子発現の最高値（５．２５倍）と最低値（０．０９倍）は、それぞれ乾燥ストレスの１８日目と２４日目とみなされる変異体Ｙ３０で測定された（図７Ｄ）。

MsNAC 遺伝子発現は大きなばらつきを示し、対照植物と変異体植物では乾燥ストレスの時間と期間に基づいて大きさが変化しました (図 7E)。 例えば、乾燥ストレスの18日目では対照Z1植物には有意差はなかったが、同じ時間間隔で対照Z2植物では16.01倍の増加が測定された(図7E)。 MsNAC 遺伝子の発現は、変異体 X6 (100.4 倍)、Y20 (0.63 倍)、および Y35 (0.55 倍) で有意な減少を示しましたが、変異体 Y30 は乾燥ストレスの 18 日目に 1.44 倍の増加を示しました (図.7E）。 参照遺伝子と比較して、干ばつストレスの 24 日目に、MsNAC 遺伝子発現の大幅な増加 (177.32 倍) が灌漑対照 (Z1) 植物で確認された一方、変異体 Y30 では大幅な減少 (100.70 倍の減少) が観察されました。 (図7E)。

干ばつストレスは大幅な収量損失を引き起こす可能性があり、その規模はその強さと厳しさだけでなく、植物の発育段階によっても異なります14。 他の多くの重要な作物種と同様に、アルファルファの種子発芽段階は干ばつストレスに対して非常に脆弱です15。 したがって、アルファルファの生産安定性を最小限に抑え、確実にするためには、発芽段階での干ばつストレスによく耐える新しいアルファルファ品種が必要です。 以前の報告では、PEG などの高分子量の浸透圧物質が、アルファルファを含む多くの植物の発芽またはその他の発育段階で標的遺伝子型をスクリーニングするための最も一般的なアプローチの 1 つであることが示されています 16。 PEG を添加した培地での発芽と、圃場での水分欠乏条件下での植物全体の挙動との間の正の相関関係も報告されています 17。 しかし、水不足と干ばつストレス条件をシミュレートする実験室スクリーニング方法は、成功した育種プログラムの望ましい遺伝子型を決定するために信頼できるものでなければなりません18。 in vitro 発芽条件下で 35% PEG600 添加培地の存在下で 340,675 個の M3 種子をスクリーニングしたところ、目に見える測定可能な幼根の成長を示したいくつかの乾燥耐性候補が得られましたが、同じストレス条件下では対照種子では発芽が観察されず、根が健全であることを示しました。研究で使用された増殖アッセイと発芽条件により、細胞の分裂と拡大、および細胞分化を達成できる新規の乾燥耐性変異体を決定することができました（図1）。 PEG は分子量が高いため細胞壁を通過できず、木部から近くの細胞への水の流れの悪さを制御することで胚細胞の水ポテンシャルを調節することができ、主に次のような理由により細胞の成長プロセスを制限することができることはよく知られています。 turgor19 の喪失、その結果、細胞の伸長が損なわれ、種子の発芽が阻害されます20。 PEG による模擬乾燥ストレスにおける発芽変動は、アルファルファ 21、クローバー 16、小麦 22 などの他の重要な作物でも報告されています。

種子の発芽は最初の段階ですが、乾燥ストレスにさらされた苗木は回復中に生き残れなかったり、後の成長段階で何らかの成長障害が残ったりする可能性があるため、乾燥耐性のための苗木の確立を成功させるための必須条件であるだけではありません23。 さらに、発芽段階における実験室で模擬された水ストレス条件の結果は、さまざまな植物の成長段階における実際の水分欠乏条件下で確認されるべきである24。 したがって、我々は、花芽段階での最初の挿し木直後の 24 日間確立された水分欠乏条件下で、4 つの候補変異体をさらにテストしました。 今回の研究の結果、M3変異体は大きな変動を示し、農業形態学的パラメーターに対する乾燥ストレスの悪影響は、変異体の遺伝子型と適用された乾燥ストレスの期間の両方に基づいて変化することが明らかになった（表1）。 すべての変異体は、所定の時間間隔において、非灌漑対照植物（Z2）よりも優れた再成長性能と干ばつストレス条件への耐性を示し、対照植物と比較して突然変異体では乾燥ストレス条件下での光合成および光同化物の利用可能性の低下が制限されていることが示唆されました（表1）。 以前の報告では、水ストレスによりアルファルファの葉の数と葉のサイズが減少し、バイオマスが減少するが、側枝の数は特に深刻な干ばつ条件下で増加することが示されており25、これはこの研究の対応する結果と一致しました（表1）。 乾燥ストレス下で植物の葉面積が減少する主な理由は、乾燥ストレス条件下での光合成速度の低下による葉の膨圧圧力、樹冠温度の低下、光同化物の利用可能性であることが示されています26。 気孔の制限は、軽度の干ばつ条件下での光合成速度の低下の主な要因の1つであることが示されていますが、光合成の減少などの非気孔性要因が、重度の干ばつ条件下での光合成速度の低下の主な理由であることが示されています26。

重度の干ばつストレスは干し草の収量と粗タンパク質（CP）含有量を減少させ、繊維質を増加させるためアルファルファの草の消化率が低下しますが、アルファルファの収量と組成に対する乾燥ストレスの影響はアルファルファの品種によって異なる可能性があります27。 以前の報告では、干ばつストレスにより水溶性炭水化物の割合に対する CP の比率が減少し、反すう動物の過剰窒素が減少する可能性があることが示されています 27。 灌漑した植物 (Z1) と灌漑していない対照植物 (Z2) の両方のタンパク質含量とは対照的に、乾燥ストレスにより変異体 Y20 および Y30 のタンパク質含量は増加しましたが、変異体 Y30 ではタンパク質含量は変化しませんでした (図 2)。 これらの発見は、EMSがアルファルファのゲノムにさまざまなタイプの点突然変異を引き起こし、対照と比較して乾燥ストレスに応じて異なる調節を受ける突然変異体のタンパク質生合成経路を引き起こしたことを示唆した。 干ばつストレス条件下での動物の給餌には高タンパク質レベルが極めて重要であるため、この研究で決定された新規変異体は、育種プログラムにおいて新たな干ばつ耐性アルファルファ品種を開発するための重要な資源として使用される可能性がある。

干ばつストレスは最初に活性酸素種 (ROS) の形成を引き起こし、細胞内の脂質やタンパク質の機能を妨げることによって酸化的損傷を引き起こします28。 干ばつストレスの有害な影響を防止または軽減するために、植物は酵素的または非酵素的抗酸化防御システムを使用します 29 が、一般に酵素防御システムが最も効果的であると考えられています 30。 抗酸化酵素は、細胞の代謝活動の結果として現れる天然の ROS が細胞内構造に損傷を与えるのを防ぎます 28。 ROS の産生は乾燥ストレスに反応して増加することもよく知られています 28。APX、GR、SOD などの抗酸化酵素は、ROS の解毒に非常に重要な役割を果たし、ROS の増加に伴って発生する可能性のある潜在的な損傷から細胞を保護します 31。 干ばつ耐性のあるアルファルファや他のいくつかのマメ科植物は、抗酸化酵素活性を高めることで、干ばつや塩分ストレスの悪影響に対する耐性が強くなります 32。 この研究の結果は、変異体の SOD、APX、および GR 含有量が灌漑されていない対照とは明らかに異なることを示しました。 (Z2) (図 3、5、6)。 例えば、対照および変異体X6と比較して、変異体Y20、Y30およびY35では、乾燥ストレスの18日目にSOD酵素活性が減少しましたが、乾燥ストレスの24日目には同じ酵素活性が増加しました（図3）。 これらの発見は、特定の変異体における乾燥ストレスの18日目におけるSOD酵素活性の低下は、乾燥ストレスそのものではなく、花芽段階での切断効果に直接関係している可能性があることを示唆しました（図3）。 また、変異体が対照植物よりも遅れて乾燥ストレスを感知する可能性があり、乾燥ストレスの24日目におけるSOD酵素活性レベルの上昇は、EMS変異原のランダムな点突然変異により変異体の乾燥耐性が向上していることを示している(図1)。 3）。

TBARS は、ストレスに応じた脂質酸化を検出するための最も一般的なパラメーターの 1 つです1。 MDA は不飽和脂肪酸のエンドペルオキシドの分割生成物であり、チオバルビツール酸 (TBA) と反応して TBARS33 を形成します。 長期にわたる干ばつストレスにより、変異体 X6 および Y20 の TBARS レベルが増加しましたが、変異体 Y30、Y35、および灌漑なしの対照 (Z2) では同様の TBARS レベルが測定されました。このことは、MDA 蓄積と関連酵素活性が変異体 X6 と Y20 で異なるように調節されている可能性があることを示唆しています。他の変異体に対する影響6、または関連する変異体における脂質過酸化を評価するために使用すると、重大な欠点が明らかになる34。 APX と GR はアスコルビン酸 - グルタチオン (AsA - GSH) サイクルの重要な酵素であり、ストレス条件下で光合成生物における有毒レベルの H2O2 の蓄積を防ぎます 35。 APX および GR 活性は、さまざまな植物種で干ばつなどのさまざまなストレス条件下で増加することが示されていますが 32、この研究では、これらの酵素活性が変異体では両方の対照植物よりも大幅に低いことがわかり、酸化損傷がまったく発生していないことを示唆しています。突然変異体は、対照植物と比較して、突然変異体における悪影響が少なかった。

植物における非生物的ストレス関連遺伝子の転写レベルおよび転写後レベルは、水分欠乏条件下で変化します36。 この研究の結果は、乾燥に関連するMtP5CS、MtDehyd、MseIF-2、MtRD2、およびMsNAC遺伝子の発現パターンが、対照植物と比較して変異体で差次的に調節されることを明らかにした（図7）。 変異体 X6 では、干ばつストレスの両方の時間間隔 (18 日と 24 日) ですべての遺伝子の下方制御の存在が見られましたが、他の変異体の遺伝子制御パターンは、干ばつストレスの時間と期間に基づいて変化しました (図 7)。 ）。 乾燥ストレスの18日目におけるMtP5CS遺伝子の発現レベルは、変異体X6を除いて対照Z2よりも変異体で有意に低かったが、長期にわたる乾燥ストレスは同じ遺伝子の下方制御を引き起こした(図7)。 乾燥ストレスの18日目におけるMtDehyd、MseIF-2およびMtRD2遺伝子の発現レベルは、変異体Y20、Y30およびY35で上方制御されたが、対照Z2は同じ時間間隔で変異体よりも低い発現レベルを示した（図7）。 。 一方、長期の干ばつストレス（24日間）は、対照Z2の発現レベルが発現しないか、変異体よりも低かったにもかかわらず、変異体ではMtDehyd、MseIF-2、およびMtRD2遺伝子の深刻なダウンレギュレーションを引き起こした（図7）。 MsNAC 遺伝子発現の下方制御と上方制御の両方が両方の時間間隔 (18 日と 24 日) で変異体で観察されましたが、同じ遺伝子は与えられた時間間隔で非灌漑対照 (Z2) 植物で有意に上方制御されました。 これらの結果は、変異体が干ばつストレスに応答して異なる作用機序を有し、本研究で試験された干ばつ関連遺伝子の転写制御が早期の警告を提供し、対照と比較して変異体が長期の干ばつストレスに対してより耐性になることを示した。 乾燥関連遺伝子発現の結果も、TBARSを除く、乾燥ストレスの18日目に変異体で測定された酵素活性レベルとの一致を示した(図7)。 対照植物は、乾燥ストレスの18日目に変異体よりも高いSOD、APX、およびGR酵素活性を示しましたが、変異体Y20およびY30は、乾燥ストレスの24日目に対照植物よりも低いAPXおよびGR酵素のレベルを示しました（図7） 。 これらの発見は、変異体の転写および転写後制御が、対照と比較して、与えられた乾燥ストレス条件に応答して独特の作用機序を有することを示唆した。

結論として、この研究の結果は、35% PEG600を添加した根成長アッセイにおけるM3アルファルファ種子のスクリーニングにより、花芽での最初の切断後24日間適用された水分欠乏条件にも耐える、新規の乾燥耐性突然変異体を決定できたことが明らかになった。ステージ。 しかし、この研究で決定された新しい乾燥耐性アルファルファの遺伝子型は、干し草の収量、栄養の質、窒素固定能力、持続可能性について圃場条件下でさらに評価される必要がある。

私たちは、植物材料の収集を含む、植物（栽培または突然変異体のいずれか）に関する実験研究および野外研究が、関連する制度的、国内的、および国際的なガイドラインおよび法律に準拠して実施されたことを確認します。 アルファルファ (Medicago sativa L.) 品種 Bilensoy-80 の 200 g の種子 (1,000 個の種子の重さは約 2 g) を、文献 37,38 に示されているように、0.15% メタンスルホン酸エチル (EMS) を 12 時間使用して突然変異誘発しました。 約４７０ｇのＭ２種子が野外で生育したＭ１植物から得られた。 M2 種子は 70 cm の空きスペースで植えられました。 M2 植物は出芽の初期段階で隔離バッグで隔離され、開花期間中約 1 か月間継続される自家受粉のために放置されました。 これらの植物のさやは手作業で収穫され、手作業で廃棄されました。 合計 340,675 個の M3 種子を、以下に示す根成長アッセイを使用した in vitro スクリーニングに使用しました。

Ｍ３種子を純粋なエタノールで１０分間処理し、次いでＨＣｌ（０．５ｍｌ／１００ｍｌ）およびＨｇＣｌ２（０．２ｇ／１００ｍｌ）を含む溶液中に２０分間保持し、次いで滅菌ｄＨ２Ｏで５回洗浄した。 5 g/L スクロース、1% 寒天、および pH 5.7 の 2 mM MES 緩衝液を含む半強度 MS 培地を、無菌条件下で使い捨て (滅菌、3 × 15 cm) プラスチック ペトリ皿に注ぎ、放冷しました。 乾燥ストレスを誘発するために、浸透法を使用して、固化した半強度 MS 培地の上部に 35% PEG を添加しました (図 1)2,39。 Bilensoy-80 品種の種子を対照として使用しました (図 1B)。 種子の休眠を打破するために、多孔質の 3 M マイクロポアテープでテープを貼ったペトリ皿を 4 °C で 48 時間保持しました。 続いて、ペトリ皿を一定の暗条件で25℃で3日間、さらに25℃で4日間、12時間光（350μmol m-2秒）を当てた制御された植物生育チャンバー内で直立位置でインキュベートした。 −1)/暗サイクル15,39。

発芽し良好な根の伸長を示した種子は、乾燥耐性候補変異体として同定され（図1C、D）、鉗子を使用してペトリ皿から除去され、ピートとパーライトの混合物で満たされたビオール（5×5cm）に移されました（図1C、D）。 3:1 v/v) (図 1E)。 ビオルは、20℃、湿度65％の生育条件で、最初の真のクローバーの葉が見えるようになるまで（図1F）、14時間光（350μmol m-2 s-1）にさらされました。 次に、最初の本葉を示した苗（3枚の葉、苗の高さ7〜10 cm）を、泥炭-パーライト（3：1 v/v）混合物を含むポット（30 cm × 30 cm）に移しました（図1G）。 植物は、前述のように所定の成長条件下で芽の段階まで成長しました（図1H）。

候補変異体は、芽の段階での最初の切断後 24 日間適用された水分欠乏条件下で再評価されました。 M3 変異体は、主茎の最初の花芽が見えるまで、前述の所定の条件下で生育し、5 cm の高さで切断されました (図 1H)。 次に、ポットが畑の水容量に達するまで灌水され、水を排出するために 24 時間放置されました 6,40。 これらのポットには合計 24 日間灌漑を行わず、乾燥ストレスの 0 日目 (対照、カット前)、18 日目、および 24 日目に葉のサンプルを採取し、生理学的および乾燥ストレスに使用するまで直ちに -80 °C で保管しました。分子分析。 農業形態学的パラメータも、干ばつストレスの所定の時間間隔で決定され、その結果が灌漑（Z1）および非灌漑（Z2）対照と比較されました6。

主茎の長さ、主茎の太さ、枝の数、葉の数、中葉の長さと幅、および植物の樹冠温度を、乾燥ストレスの 18 日目と 24 日目に測定しました。 各植物からランダムに選択された 5 つのさやを使用して、さやあたりの種子収量を決定し、各植物から得られた M4 種子の量 (g/植物) を決定しました。 主幹の太さは、主幹の第２枝と第３枝との間で、０．１ｍｍの分割ノギスで測定することによって決定した。 中央の小葉の長さと幅は、主茎の 4 番目と 5 番目の葉から決定されました6。 葉のサンプルを採取する前に、レーザーマーク付き赤外線温度計 (IR988) を使用して、各植物の下部、中部、上部に属する 3 つの異なる点から植物の温度を測定しました。

ストレスの 0 日目 (コントロール、切断前)、18 日目、および 24 日目の既存の組織を使用して、タンパク質含有量、スーパーオキシドジスムターゼ (SOD) アイソザイムおよびチオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) レベル、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APX) 酵素および3 つの生物学的複製を伴うグルタチオン レダクターゼ (GR) 酵素活性。

ブラッドフォード法によるウシ血清アルブミン (BSA) 標準を使用して、総可溶性タンパク質含量を決定しました 41。 この方法により形成されたチオバル酪酸 (TBA)-MDA 複合体の含有量を、分光光度計で A532 および A600 nm で測定しました。 組織中の MDA 含有量は、次の式を使用して計算されました: MDA 含有量 = [(A532 − A600) × 抽出量 (ml)] / [155 mM/cm × サンプル量 (mg)]。 SOD 酵素活性は、ニトロブルーテトラゾリウム (NBT)42 の光化学還元に基づく方法に従って、560 nm で分光測光的に測定しました。 APX 酵素活性は、所定の文献 43 に基づいて決定されました。 組織内の総APX酵素活性は、アスコルビン酸の吸光係数（2.8 mM.cm-1）を使用して、初速度（nmol.ascorbate.min-1.mgタンパク質-1）から計算されました。 GR 酵素活性は、文献 44 に記載されているとおりに実行されました。 サンプルの総 GR 酵素活性は、NADPH の吸光係数 (6.2 mM cm-1) を使用して非酵素酸化を差し引いた後の反応の初速度 (nmolNADPH.min-1.mg タンパク質-1) から計算されました。

葉サンプルのトータル RNA の分離は、市販の RNA 抽出キット (Vivantis GF-1) を使用して、同社が指定したプロトコールに従って完了しました。 単離されたRNAの品質は、ナノドロップデバイスを使用した260/280 nmでの分光測定によって決定され、さまざまな酵素の汚染を防ぐために専用のゲル電気泳動システムを使用して2％アガロースゲルでも確認されました（補足図1）。

第一鎖 cDNA は、4 μl のトータル RNA RevertAid 第一鎖 cDNA 合成キット (Thermo Fisher Scientific、米国) を使用して合成しました。 乾燥ストレスに対する特定の遺伝子の発現の違いは、関連する遺伝子特異的プライマーを使用した RT-qPCR (StepOne 7500、Applied bioscience) によって検出されました (補足表 1)。 RT-qPCR 分析の前に、すべての遺伝子のプライマーをテストして、最適な結合温度とアンプリコンの状態を決定しました。 さらに、プライマーと PCR 産物の特異性もテストされ、RT-qPCR 分析の最後に実行される融解曲線分析によって確認されました。 RT-qPCR 条件を 95 °C で 15 分間適用し、続いて 95 °C で 40 秒、55 °C で 40 秒、および 72 °C で 30 秒を 40 サイクル適用しました。 PCR 反応の最後に、融解曲線分析を 58 ～ 92 °C で実行しました。 アニーリングの特異性を確認するために、実験の最後に解離速度論分析を実施しました。

ハウスキーピング遺伝子として、Ms18srRNA および MsActin 参照遺伝子が RT-qPCR 分析で同時にテストされました 6,45。 Ms18srRNA 遺伝子はより安定であり、テクニカルリピート間の変動が少ないことが判明したため、これを RT-qPCR 増幅の内部対照として使用し、結果を 2-デルタ-デルタ Ct 法と比較しました 46。 すべての qPCR 実験では MIQE ガイドラインに従いました 47。

遺伝子発現レベルは、乾燥ストレスの 0 日目 (対照、切断前)、18 日目、および 24 日目に採取した葉組織で、3 回の技術的反復により測定されました。 デバイス (StepOne 7500、Applied bioscience) のマニュアルで推奨されている設定を使用して、アンプリコンの臨界閾値 (Ct) を決定しました。 技術的反復間のデルタ Ct 標準偏差値 ≥ 0.25 を繰り返しました。 相対量（2-delta-delta Ct）の計算では、対照遺伝子発現におけるRQ（Relative Quantification）値を1として、サンプルの発現変化の2倍以上0.5倍未満とした。結果の解釈に使用されました。 さらに、遺伝子発現グラフの作成には対数指標チャートが使用され、特に参照遺伝子と比較して 0.5 倍未満の発現変化を見ることができました。

農業形態学的データ（中央葉の長さと幅、植物の樹冠の温度、さやごとの種子の数）は、SAS パッケージ プログラム 48 を使用して一元配置分散分析に供されました。 生理学的パラメータは、方法セクションで指定された関連参考文献の方法に従って分析されました。 データの平均間の差異は、LSD テストを使用して P < 0.05 レベルでテストされました。 分子データは、内部対照として Ms18srRNA 遺伝子を使用する 2-デルタ-デルタ Ct 法に従って正規化され、関連遺伝子の発現レベルが決定されました 46,49。 p < 0.05 レベルでの有意差は、図の列の上に異なる文字で示されました。

ラザ、A.ら。 作物の適応に対する気候変動の影響とその結果に取り組む戦略: レビュー。 Plants (バーゼル) 8、34 (2019)。

論文 CAS PubMed Central Google Scholar

Verslues, PE、Agarwal, M.、Katiyar-Agarwal, S.、Zhu, J. & Zhu, JK 植物の水の状態に影響を与える、干ばつ、塩分、凍結、非生物的ストレスに対する耐性を定量化する方法と概念。 Plant J. 45、523–539 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

サンドゥ、N.ら。 高地干ばつストレス下での米粒収量に対する主効果とエピスタシス効果を伴う安定したQTLの同定とマッピング。 BMCジュネット。 15、63 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

セレイマン、MF 他干ばつストレスは植物に影響を与え、その悪影響を軽減するためのさまざまなアプローチをとります。 Plants (バーゼル) 10, 259 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Basu, S.、Ramegowda, V.、Kumar, A. & Pereira, A. 干ばつストレスに対する植物の適応。 F1000Res 5、1554 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Quan, W.、Liu, X.、Wang, H. & Chan, Z. 2 つの対照的な乾燥耐性アルファルファ品種の比較生理学的および転写分析。 フロント。 植物科学。 6、1256 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Radović, J.、Sokolović, D. & Marković, J. アルファルファ - 畜産において最も重要な多年生飼料マメ科植物。 バイオテクノロジー。 アニム。 夫。 25、465–475 (2009)。

記事 Google Scholar

Kulkarni、KP et al. 持続可能な農業と世界の食料安全保障のために、飼料マメ科植物、アルファルファ、大豆、ササゲの可能性を活用します。 フロント。 植物科学。 9、1314 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Havananda, T.、Brummer, EC & Doyle, JJ アルファルファとその仲間 (Medicago sativa、マメ科) における自己倍数体進化の複雑なパターン。 Am J Bot 98、1633 ～ 1646 年 (2011)。

論文 PubMed Google Scholar

Huang、Z.ら。 乾燥地帯（中国）における年代に伴うアルファルファ（Medicago sativa）草原の土壌水分貯蔵不足。 Field Crop Res 221、1–6 (2018)。

記事 Google Scholar

Shi, S.、Nan, L. & Smith, KF 中国におけるアルファルファ (Medicago sativa L.) 繁殖の現状、問題点、および展望。 農学 7、1–11 (2017)。

記事 Google Scholar

Biazzi、E. et al. アルファルファ (Medicago sativa) 飼料品質形質のゲノムワイド関連マッピングとゲノム選択。 PLoS ONE 12、e0169234 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

サキログル、M. & ブルマー、EC GBS-GWAS を使用した二倍体アルファルファの飼料収量と栄養価を制御する遺伝子座の同定。 理論。 応用ジュネット。 130、261–268 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zia, R.、Nawaz, MS、Siddique, MJ、Hakim, S. & Imran, A. 干ばつストレス下での植物の生存: ストレス緩和のための含意、適応応答、および統合された根圏管理戦略。 微生物。 解像度 242、126626 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Castroluna, A.、Ruiz, OM、Quiroga, AM、および Pedranzani, HE 3 種類の Medicago sativa L の発芽、バイオマスおよび成長に対する塩分および干ばつストレスの影響。Advances In Agriculture Research 18、39–50 (2014)。

Google スカラー

Kintl、A.ら。 5 種類のクローバー作物の発芽能力に対する種子のコーティングとペグ誘発性の干ばつの影響。 Plants (バーゼル) 10, 724 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Dragiiska , R. 、Djilianov , D. 、Denchev , P. & Atanassov , A. アルファルファ (Medicago sativa L.) の浸透圧耐性に関する in vitro 選択。 バルグ。 J. 植物生理学。 22、30–39 (1996)。

Google スカラー

Cai, K. et al. 乾燥耐性に関する世界中の大麦収集のスクリーニング: 選択基準としてのさまざまな生理学的尺度の評価。 フロント。 植物科学。 1159 年 11 月 (2020 年)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Michel, BE & Kaufmann, MR ポリエチレングリコール 6000 の浸透圧ポテンシャル。植物生理学。 51、914–916 (1973)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nonami, H. 植物の水の関係と低水ポテンシャルにおける細胞伸長の制御。 Ｊ．植物研究所。 111、373–382 (1998)。

記事 Google Scholar

Zhao, Y.、Wei, X.、Long, Y. & Ji, X. 転写分析により、ニトロプルシドナトリウムが発芽段階のPEG誘発浸透圧ストレスに応答してアルファルファに影響を与えることが明らかになりました。 プロトプラズマ 257、1345–1358 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bahi, M.、Lutts, S. & Kinet, JM 乾燥耐性が異なるデュラム小麦 (triticum durum desf.) 品種から作られたカルス培養におけるポリエチレングリコール誘発水分欠乏への曝露と回復後の生理学的変化。 J. 植物生理学。 156、75–83 (2000)。

記事 Google Scholar

ウォーターワース、WM、ブレイ、CM、ウェスト、CE 発芽と種子の寿命におけるゲノムの完全性を保護することの重要性。 J.Exp. ボット。 66、3549–3558 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

JD スカスタ、CL トロッスル & マサチューセッツ州フォスター 実験室、温室、野外の方法を使用して、アルファルファ (Medicago sativa L.) 品種の耐塩性を評価しています。 Ｊ．アグリック． 科学。 4、90–103 (2012)。

Google スカラー

Luo、YZ、Li、G.、Yan、GJ、Liu、H.、Turner、NC 水分ストレスにさらされたルツェルン植物 (Medicago sativa L.) の形態学的特徴とバイオマス分配。 Agron.-バーゼル 10、322 (2020)。

記事 Google Scholar

ヤン、Ｘら。 乾燥ストレスに対する植物の応答メカニズム。 Horticulturee 7、1–36 (2021)。

Google スカラー

Liu, Y.、Wu, Q.、Ge, G.、Han, G.、Jia, Y. アファルファの収量と栄養組成に対する干ばつストレスの影響。 BMCプラントバイオル。 18、13 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Shi、Y.ら。 OsRbohB を介した ROS 産生は、イネの乾燥ストレス耐性において重要な役割を果たします。 Plant Cell Rep. 39、1767–1784 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liu、YSら。 アルファルファ (Medicago sativa L.) の低温耐性と抗酸化反応に対する根粒菌の共生の影響。 フロント。 植物科学。 10, 538 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マサチューセッツ州ファルークら。 制御の獲得：植物ストレス応答における ROS 誘発酸化ストレスと酸化還元シグナル伝達経路の進化。 植物生理学。 生化学。 141、353–369 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Khanna-Chopra, R. & Semwal, VK スーパーオキシドジスムターゼとアスコルビン酸ペルオキシダーゼは、アカザアルバムの他の抗酸化酵素よりも構成的に耐熱性が高い。 生理。 モル。 バイオル。 Plants 17、339–346 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sachdev, S.、Ansari, SA、Ansari, MI、Fujita, M. & Hasanuzzaman, M. 非生物的ストレスと活性酸素種: 生成、シグナル伝達、および防御メカニズム。 酸化防止剤 (バーゼル) 10, 277 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Davey, MW、Stals, E.、Panis, B.、Keulemans, J. & Swennen, RL 植物組織中のマロンジアルデヒドのハイスループット定量。 アナル。 生化学。 347、201–207 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アワスティ、JP et al. シッフ試薬による多重ストレス下の植物における脂質過酸化の定性分析: 組織化学的アプローチ。 バイオプロトック。 8、e2807 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Semwal, VK & Khanna-Chopra, R. アカザアルバム (Bathua) では、水分欠乏ストレスと熱ストレスの組み合わせでは、酸化ストレス、損傷、および不十分な抗酸化防御の強化が、いずれかのストレス単独と比較して回復不十分の一因となっています。 生理。 モル。 バイオル。 Plants 26、1331–1339 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガリーノ、JP 他しおれが遅いダイズ品種で同定された脱水誘導性真核生物翻訳開始因子iso4gは、シロイヌナズナの非生物的ストレス耐性を強化する。 フロント。 植物科学。 9, 262 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Dhulgande、GS、Dhale、DA、Pachkore、GL & Satpute、RA エンドウ豆 (Pisum sativum L.) におけるガンマ線とメタンスルホン酸エチルの変異原性の有効性と効率。 J.Exp. 科学。 2、7–8 (2011)。

CAS Google スカラー

Gaikwad, NB & Kothekar, VS レンズ豆における EMS および SA の変異誘発剤の有効性と効率。 インドのJ.ジュネット。 64、73–74 (2004)。

Google スカラー

Wang、WBら。 塩分および乾燥ストレス下でのアルファルファ発芽時の抗酸化酵素活性の分析。 Plant Physiol Biochem 47、570–577 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Levitt, J. 環境ストレスに対する植物の反応 (Academic Press、1980)。

Google スカラー

Bradford, MM タンパク質と色素の結合原理を利用した、マイクログラム量のタンパク質を定量するための迅速かつ高感度な方法。 アナル。 生化学。 72、248–254 (1976)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Beyer, WF & Fridovich, I. スーパーオキシドジスムターゼ活性のアッセイ: 状態の小さな変化による大きな影響。 アナル。 生化学。 161、559–566 (1987)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, SY, Jiao, HJ & Faust, M. チジアズロンによるリンゴの芽割れ時のアスコルビン酸塩、グルタチオン、および関連酵素活性の変化。 生理。 植物。 82、231–236 (1991)。

記事 CAS Google Scholar

Sgherri、CLM、Liggini、B.、Puliga、S.、Navari-Izzo、F. Sporobolus stapianus の抗酸化システム: 乾燥と再水和に応じた変化。 植物化学 35、561–565 (1994)。

記事 CAS Google Scholar

Rocher, S.、Jean, M.、Castonguay, Y. & Belzile, F. 454 シークエンシングによる 4 倍体アルファルファ集団におけるシーケンシングによる遺伝子型解析の検証。 PLoS ONE 10、e0131918 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Livak, KJ & Schmittgen, TD リアルタイム定量 PCR と 2(-Delta Delta C(T)) メソッドを使用した相対的な遺伝子発現データの分析。 方法 25、402 ～ 408 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

バスチン、SA et al. MIQE 精度: 蛍光ベースの定量的リアルタイム PCR 実験のための最小標準ガイドラインの実際的な実装。 ＢＭＣモル． バイオル。 11、74 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

SAS、I. SAS/STAT ソフトウェア: リリースによる変更と機能強化、Vol. S 6.12.、SAS。 (ノースカロライナ州ケーリーの研究所; 1997)。

Soufi, S. et al. ステビオール配糖体は、低温ストレス条件下で栽培された植物からのステビア レバウディアナ (ベルトーニ) の葉の分析を対象としました。 食品化学。 190、572–580 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究の財政的支援は、トルコ科学技術研究評議会 (TUBITAK) から研究助成金 TOVAG-116O417 によって提供されました。 RT-qPCR の使用を許可してくれた Melih Taskin 博士に感謝します。 また、それぞれ畑での収穫と自家受粉について協力してくれたフセイン・ケレスとセムン・タイヤルに感謝したいと思います。 また、実験室での実験と対照条件での変異体の増殖に協力してくれた Enes Gokhan Yilmaz、Beste Celep、Erman Cavusoglu、および匿名の研究室メンバーに感謝したいと思います。

チャナッカレ・オンセキス・マート大学、テルツィオグル・キャンパス、17000、チャナッカレ、トルコ、農学部、農業バイオテクノロジー学科

イスケンデル ティリヤキ、ウグル サリ、セルチュク セティン

チャナッカレ・オンセキス・マート大学、芸術科学部生物学科、17100、チャナッカレ、トルコ

オカン・アカール

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

IT 部門がアイデアを考案し、財政的支援を与え、実験を計画し、分析を実行し、データを解釈し、図を設計し、原稿を作成しました。 米国はスクリーニングとRT-qPCR分析を考案した。 SCは農業形態学的パラメータに関連するデータを収集し、研究中に技術支援を実施し、OAは酵素分析を実施しました。 著者全員が原稿を読んで承認しました。

イスケンデル・ティリヤキへの通信。

著者らは利益相反がないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Tiryaki, I.、Sari, U.、Cetin, S. 他発芽段階での in vitro スクリーニングによる EMS 変異誘発アルファルファ (Medicago sativa L.) 変異体の乾燥耐性の向上。 Sci Rep 12、12693 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 2 月 15 日

受理日: 2022 年 7 月 7 日

公開日: 2022 年 7 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。