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Apr 07, 2023

遺伝子操作によるキュウリとトマトにおける異種モグロシド生合成

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 191 (2023) この記事を引用

2089 アクセス

12 オルトメトリック

メトリクスの詳細

モグロシドは、さまざまな生物学的活性を示し、最新の分子バイオテクノロジーによる野菜風味の育種を可能にする、高価値の天然ゼロカロリー甘味料として広く使用されています。 この研究では、導入遺伝子スタッキングのための融合ベースの遺伝子スタッキング戦略と、6 つのモグロシド生合成遺伝子を含むマルチ遺伝子ベクターを開発し、Cucumis sativus および Lycopersicon esculentum に形質転換しました。 今回我々は、トランスジェニックキュウリがモグロシド V とシアメノシド I をそれぞれ 587 ng/g FW と 113 ng/g FW で生産できること、およびモグロシド III を含むトランスジェニックトマトを栽培できることを示す。 この研究は、野菜の風味を改善するための戦略を提供し、モグロシドの異種生合成への道を開きます。

食品の風味に対する好みは人類の進化の歴史全体に浸透しており、この好みは時には人間の栄養要求量よりも高くなることがあります。 風味は食べ物の好みにおいて極めて重要な役割を果たしており、美味しさは喜びの感覚をもたらし、食欲、消化の改善、栄養素の利用率の向上に重要な意味を持ちます1。 さらに、人類はすでに野菜や果物の風味を改良し始めており、それが最終的には食事支出の向上と人間の健康の改善につながっています2。 過去半世紀にわたり、作物の生産性を高めるという品種改良の目標は、間接的に風味と栄養素の低下を引き起こしてきました3。 遺伝的連鎖により、品質形質は収量と負の関係があるように見え、望ましい風味、高収量、高品質は複数の遺伝子によって制御される複雑な形質です4。 したがって、一般に、風味を高めるための植物育種は、高収量と高品質に基づいた大きな課題のままです。 1983 年以来、トランスジェニック バイオテクノロジーの大きな進歩により、風味と栄養価を高めるための育種がより簡素化され、実現可能になりました 5。 以前に示したように、現代の市販トマト品種には風味に関連する揮発性物質が明らかに存在しません。 その結果、科学者たちは、オシマム・バシリカム・ゲラニオール合成酵素の発現を介して果実がレモンの風味とバラのような香りを示すようにトマト植物を改変しました6。 さらに、TomLoxC は、脂質由来の C5 および C6 の揮発性生合成を触媒することにより、トマトの果実の風味に影響を与えることが広く知られています 7。 さらに、以前の研究では、バニリン生合成を制御する VpVAN 遺伝子の変化がペッパーの独特の風味を変化させたことが示されています8。 明らかに、風味に関連する同種または異種の導入遺伝子を含む植物育種は、将来的にも継続される可能性が高い人気の研究テーマとなっています。

甘味の好みは人間の本能の一種であり、甘味は基本的な快楽の喜びであると説明されています9。 必須成分として砂糖を含む甘い食べ物は、世界中のあらゆる年齢層で肥満、糖尿病、心血管疾患を著しく増加させています10。 したがって、毎日の食事で使用できる砂糖を含まない甘味料を検討する必要があります。 同様に、科学者たちは、甘い味の作物を育種するために、甘い味のタンパク質をキュウリ 11、トマト 12,13、イチゴ 14、梨 15、レタス 13,16 に変換しました。 しかし、甘味タンパク質は一般に、価格の高さ、供給不足、味の悪さ、保存期間と安定性の短さによって制限されていました17。 1983 年に、独特の Siraitia grosvenorii 果実 (ウリ科、羅漢果またはモンクフルーツ) から単離された非糖甘味料であるモグロシド V が中国で発見され 18,19,20 、2010 年に FDA によって承認されました。モグロシドは、モグロシド III、シアメノシド I、モグロシド V などのいくつかの甘味成分に分類されます。モグロシドの甘味は、グリコシル化およびグリコシル化部位の数に応じて異なります21。 モグロシド V の大きな利点は、通常わずかに苦くて甘いステビオシド、ルブソシド、グリチルリチンと比較して、その優れた風味にあります 22,23。 興味深いことに、抗糖化効果のあるこの天然甘味料 24 は、甘味が高く、カロリーが低く、毒性がありません。 その甘味はスクロースの約 300 倍です 25,26。 そしてその医療用途の歴史は 300 年以上です27。 モグロシドは、国内外のあらゆる種類の有名ブランドによって承認および使用されており、2019 年 9 月末までに世界中で 4,300 以上の製品に適用されています。中国では、モグロシドは一種の製品であると考えられています。安全で無毒の天然甘味料であり、食品、飲料、製薬業界で広く使用されており、世界中で大きな商業的可能性を秘めています27。 2011 年に、私たちのグループはモグロシド V 生合成経路を調査し、40 の主要な酵素をコードする遺伝子を初めてクローニングしました 28。これは、甘味を改善するための作物育種のためのドナー遺伝子を提供しました。 文献によると、モグロシド V 生合成の前駆体である 2,3-オキシドスクアレンは植物に広く存在します 29 (補足図 S1)。 したがって、甘味植物を開発するには、さまざまなモグロシド V 合成酵素遺伝子を候補植物に形質転換することが非常に重要であり、これらのトランスジェニック植物はモグロシド V 生産の有望な材料としても使用できます。

過去 30 年間、一部の国や地域では商業栽培を促進するために、単一の形質を遺伝的に改良した多くのトランスジェニック植物が応用されてきました 30。 代謝工学と合成生物学の発展に伴い、単一遺伝子形質転換ではなく、多重遺伝子形質転換が生合成の制御と複数の生物学的特性の改善に適用されるようになり、これは遺伝育種における新たな傾向となっています 31。 現在までに、β-カロテンが豊富なゴールデンライス32、ジャガイモ33、バナナ34、キャノーラ35、アントシアニン36、L-DOPA-37、葉酸38などの微量栄養素、植物栄養素、生物活性成分の生物活性成分を強化するために遺伝子組み換えされた植物では、数多くの画期的な進歩が見られています。フラボノール 39、ベタレイン生物強化 40 トマト果実は、標的代謝産物生合成経路を含む多重遺伝子形質転換によって開発されました。 モグロシド V の新規合成を達成するための重要な問題は、6 つのモグロシド生合成遺伝子を候補植物に組み込むことです。 したがって、我々は、In-fusion 技術と自己切断 2A ペプチドに基づいた、シンプルで効率的な多重遺伝子発現システムを開発しました。 さらに、6 つのモグロシド V シンターゼ遺伝子がキュウリとトマトに導入されることに成功し、トランスジェニック植物ではすべての遺伝子が高い転写レベルを示しました。 そこで、まずモグロシドVを導入した甘味キュウリとモグロシドIII（MIII）を導入した微甘味トマトの遺伝子組み換え植物を開発した。 この研究は、野菜と果物のフレーバー育種の分野における広範な前向き応用について説明しており、特定の特徴と複数のフレーバーを備えた優れた植物生殖質を精巧に開発するための貴重で魅力的な青写真を提供します。

AtUBQ10およびAtPD7プロモーターをシロイヌナズナから単離し、GUSレポーター遺伝子とともにpBI121ベクターに連結しました（図1a）。 プロモーターの適合性を評価するために、以前に記載されているように、Cucumis sativus の子葉で一過性発現を実行しました 41。 ベンサミアナタバコの葉とキュウリの子葉を、同じ条件下でGUS遺伝子がAtUBQ10、AtPD7、およびCaMV 35Sプロモーターによって駆動されるpBI121を保有するアグロバクテリウムに感染させた。 これらのプロモーターの機能を特徴付けるために、以前に記載されているように組織化学的染色を実施しました42。 予想どおり、Cucumis sativusおよびNicotiana benthamianaではAtUBQ10およびAtPD7プロモーターの制御下で高レベルのGUS活性があり（図1b、c）、最高の発現レベルはCucumis sativusの浸潤後5日目に検出されました。 したがって、AtUBQ10およびAtPD7プロモーターのCucumis sativusおよびNicotiana benthamianaにおける遺伝子転写を駆動する能力は、CaMV 35Sプロモーターの能力に匹敵し、これらのプロモーター間に有意差はありませんでした（図1bおよび図1c）。 したがって、これらのプロモーターは、多重遺伝子ベクターでの遺伝子発現を駆動するための強力な構成プロモーターとして使用できます。

異なるプロモーターを備えた組換えプラスミド。 b キュウリの一過性発現の組織化学的 GUS アッセイ。 c タバコへの浸潤の48時間後に、一過性発現の組織化学的GUSアッセイを実施した。 WT植物を陰性対照として使用した。 35Sプロ：CaMV 35Sプロモーター。 AtUBQ10プロ：AtUBQ10プロモーター。 AtPD7プロ：AtPD7プロモーター。

モグロシド生合成の前駆体は 2,3-オキシドスクアレンであり、メバロン酸経路を通じて合成され、一連の酵素によって触媒されて Siraitia grosvenorii でモグロシド V を合成することが広く証明されています（補足図 S1）。 したがって、モグロシド合成関連酵素コード遺伝子 SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1、および SgUGT289-3 を、AtPD7、AtUBQ10、および CaMV 35S によって駆動される Hyg 耐性遺伝子 (Hyg、選択マーカー) とともに保持するバイナリー プラスミド pCAMBIA1300プロモーターは、In-fusion技術と自己切断2Aペプチドを介して構築されました（補足図S2a）。 まず、すべての標的遺伝子を pBI121 または pCAMBIA1300 に連結して、最初の遺伝子発現カセットを作成しました。 第二に、プロモーター、標的遺伝子、およびターミネーターを含む領域をクローニングし、pCAMBIA1300に連結して、二重遺伝子発現カセットを生成しました。 次に、最初の遺伝子発現カセットと二重遺伝子発現カセットを組み合わせて、三重遺伝子発現カセットを構築しました。 最後に、三重遺伝子発現カセットを P2A ペプチドによって最終ベクターに連結しました。 （補足図S2a）。 対応する U22p-SCE プラスミドは PCR によって同定されました (補足図 S2b)。 この多重遺伝子発現ベクターは大きく (左境界から右境界までの長さは約 21.5 kb)、モグロシドの合成に使用されました。 U22p-SCEプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101に導入し、形質転換体をさらに遺伝子形質転換に使用した。

多重遺伝子ベクターの利用可能性をさらに確認するために、Cucumis sativus で一過性発現アッセイを実行しました。 すべてのモグロシド生合成関連遺伝子は、アグロインフィルトレーションを介してCucumis sativusの子葉で発現されました。 予備研究の方法に従って、HPLC-ESI-MS/MS分析のために、浸潤後5日目にCucumis sativusの子葉をサンプリングし、48時間後にタバコの葉の子葉をサンプリングしました。 補足図S3aおよびS3bに示すように、MII-EおよびMIIIは、U22p-SCE多重遺伝子発現ベクターで形質転換されたキュウリの子葉にわずかに蓄積しましたが、MI-A1は検出されませんでした。 残念ながら、多重一過性発現アッセイでは SI または MV は観察されませんでした。 SI および MV の蓄積がないことは、少なくとも 2 つの可能性を示唆しました: (i) 一過性発現アッセイは一般に短時間継続しました。この場合、MIII 基質の蓄積は子葉における SI および MV の生成には不十分でした。 (ii) 多重遺伝子発現ベクターが大きすぎて遺伝子発現を抑制できず、その結果 MII-E と MIII が減少しました。 それにもかかわらず、一過性発現アッセイにより、多重遺伝子発現ベクターが利用可能であることが確認された。 したがって、Cucumis sativusおよびLycopersicon esculentumへの遺伝子形質転換には、多重遺伝子発現ベクターの安定した形質転換が必要であり、これはモグロシド蓄積野菜育種に関する新しいアイデアを提供する。

キュウリの栄養特性を強化するために、多重遺伝子発現ベクター U22p-SCE をアグロバクテリウム ツメファシエンス GV3101 株に導入し、キュウリ植物でモグロシドを生成するようにモグロシド生合成経路を遺伝子操作しました。 約500個のキュウリの葉外植片を、U22p-SCEベクターによるアグロバクテリウム媒介形質転換に供した。 このうち、Hyg 耐性系統の総数は約 15 系統であったが、多くの Hyg 耐性系統は発根、生存、実生生育ができなかった。 最終的に、栽培化と移植の後、温室で栽培されたトランスジェニック植物は 5 つだけでした。 すべてのトランスジェニック植物と非形質転換植物は、一貫した生育環境を備えた温室で栽培されました（図2a）。 キュウリ植物のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを検出するために（図２ｂ）、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによる遺伝子特異的プライマーを使用して標的遺伝子およびＨｙｇ遺伝子の存在を決定した（補足表Ｓ４）。 予想されたサイズの断片がすべての Hyg 耐性トランスジェニック系統で検出されました (図 2c)。 SgSQE1の1587 bp断片、SgCSの2280 bp断片、SgEPH2の951 bp断片、SgP450の1421 bp断片、SgUGT269-1の1253 bp断片、SgUGT289-3の1026 bp断片、およびHyg耐性遺伝子の392 bp断片を分析した。 1つのトランスジェニック植物（U1）で同時に検出されましたが、WTキュウリ植物からは増幅されませんでした（図2c）。 他の植物では、PCR 増幅を使用して 6 つの遺伝子すべてが存在することはほとんどありませんでした。 キュウリの形質転換実験のデータは補足表S1に記載されています。 U22p-SCE ベクターで形質転換した後、合計で 1 つの独立したトランスジェニック キュウリ系統が得られました。 この研究では形質転換頻度は比較的低かったが、6つの遺伝子が同時にキュウリゲノムに形質転換された初めての研究であり、大きなベクターの形質転換は予測不可能である。 これまでの研究では、キュウリの遺伝子形質転換効率は依然としてばらつきが大きく、使用できる外植体の遺伝子型が限られていることが示唆されています。 アグロバクテリウム媒介システムにおいて多重遺伝子ベクターによる形質転換効率を改善するには、遺伝子形質転換の重要なステップを最適化する必要があり、その主要なタスクと次の段階のターゲットが最適化されます。 さらに、qRT-PCRによって導入遺伝子の発現レベルを測定しました（図2d）。 定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) 分析により、SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1、および SgUGT289-3 の転写レベルが WT 植物で著しく高いことが明らかになりました。 このアッセイでは、6 つの導入遺伝子の発現が葉と果実で異なりました。 たとえば、6つの導入遺伝子すべてで、葉と果実の両方で比較的低いSgSQE発現が検出されました（図2d）。これは、CaMV 35Sプロモーターによって駆動される2Aペプチド構築物の2番目の遺伝子位置に位置していました（補足図S2a） ）。 最初の遺伝子位置と 2 番目の遺伝子位置の間の遺伝子発現レベルは、一般に、異なる 2A ペプチドの利用によって影響を受けました 43。 全体として、PCR および qRT-PCR 検出は、モグロシド生合成に関与する構造遺伝子がキュウリのトランスジェニック系統で発現されていることを示しました。 最後に、アグロバクテリウム媒介形質転換を使用して、U1 トランスジェニック植物のみが取得されました。

a U22p-SCEベクターを保有するアグロバクテリウムによるキュウリの遺伝子形質転換。 (1) 滅菌種子。 (2) 生後4日目の苗。 (3) 子葉を切断し、外植体として使用した。 (4) 選択した培地中の外植片。 (5) 発根培地中で再生された植物。 (6、7) 再生植物。 b トランスジェニックキュウリ系統 U1 の葉と果実。 c PCRに基づくU1の検出。 レーンは左から右に Maker、WT、U1 フルーツ、U1 リーフを表します。 DNA マーカーの画像 (4.5 kb) は図の右下隅にあります。 d qRT-PCRによるトランスジェニックキュウリ系統U1の転写レベル分析。 Csactin は内部対照として使用されます。 キュウリ WT 植物の発現を 1 に設定しました。データは平均値 ± SD、n = 3 の生物学的に独立したサンプルとして表示されます。

分子分析に基づいて、トランスジェニックキュウリ系統中のモグロシドの組成および含有量を、HPLC-ESI-MS/MSを使用して決定した。 モグロール、MI-A1、MII-E、MIII、SI、およびMV標準は、それぞれ4.01、19.38、13.88、12.03、10.14、および0.8.37分の保持時間で検出されました（図3aおよび補足図S4a）。 図3bおよび補足図S4bに示すように、モグロール、MIA-1、MII-E、MIII、およびSIは、果物でのみ見つかったMVを除き、トランスジェニックキュウリの果実と葉で検出されました。 MV は果実中に約 587 ng/g 生重量 (FW) まで蓄積され、他のモグロシドの含有量は図 3b および補足図 S4b にリストされています。 モグロシドは、WT キュウリ植物では検出されませんでした。 さらに、代謝産物は UPLC-ESI-QTOF-MS/MS によってさらに同定され、ネガティブモードでのトータルイオンクロマトグラフが図 4 に示されています。標準物質の保持時間、真の分子量および質量分析によれば、5 つのモグロシドが検出されました。は、MI-A1、MII-E、MIII、SI、MV などのトランスジェニックキュウリ U1 果実で観察されました。 また、[M + HCOO-H]- および [MH]- は、陰イオン モードの MS/MS スペクトルで一般的に観察されました。 MV の破壊モードは次のとおりです。特徴的なフラグメントにより 1 分子のギ酸が容易に得られ、MS スペクトルの m/z 1331.5443 でプロダクト イオンが生成されました。 [MH] - の脱プロトン化イオン（m/z 1285.5507）は、MS / MSスペクトルで明確に観察されました（補足図S5a）。 さらに、SIは[M + HCOO-H]-（m/z 1169.5096）を示すギ酸1分子を取得し、m/z 1123.5330で脱プロトン化イオン[MH]-を生成しました（補足図S5b）。 同様に、MS / MSスペクトルに基づいて、化合物3、4、および5はMIII、MII-E、およびMI-A1として識別されました（補足図S5c–e）。 特に、モグロシドの存在により、トランスジェニックキュウリ系統において6つの遺伝子の同時発現が成功したことが確認された。 トランスジェニックキュウリにおけるモグロシド生合成を再構築することにより、スイートキュウリを生成することに成功した。 興味深いことに、U1 休暇では、モグロシドの存在が農業廃棄物を使用した SI 生産の大きな可能性であることも証明されました。 私たちの研究では、In-fusion テクノロジーと 2A ペプチド リンカーを介した便利で効率の高い多重遺伝子形質転換戦略を開発しました。 これらの結果は、この戦略がキュウリに適用できる可能性があり、まずモグロシド蓄積野菜の開発に重要な意味を持つことを示しています。

トランスジェニックキュウリ系統 U1 におけるモグロシドの HPLC-ESI-MS/MS 分析。 黒い矢印はモグロシドのピークを示します。 b トランスジェニックキュウリ系統 U1 におけるモグロシドの蓄積。 そして、検出されませんでした。 データは平均値 ± SD、n = 3 の生物学的に独立したサンプルとして表示されます。

MIA-1、MII-E、MIII、SI、MV はそれぞれモグロシド I-A1、モグロシド II-E、モグロシド III、シアメノシド I、およびモグロシド V を表します。

同様に、多重遺伝子ベクターを Micro-Tom トマトに形質転換しました。 このアッセイでは約 500 個の外植片が形質転換され、複数の形質転換法により 20 個の Hyg 耐性トマトトランスジェニック系統が生成されました。 それらのうち、SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1、SgUGT289-3およびHyg遺伝子に対する特異的プライマーを用いたPCRによってモグロシド生合成関連遺伝子が検出された系統は4系統のみであった。 予想されるサイズの断片が、4 つの候補トランスジェニック トマト系統のゲノム DNA から得られました。 モグロシド生合成関連遺伝子はすべて、U22p-SCEベクターで形質転換された20株のうちこれら4株（S8、S10、S14、およびS17）から増幅されました（図5a）。 WT植物では標的遺伝子は観察されませんでした（図5b）。 つまり、この多重遺伝子ベクターをトマトゲノムに導入することに成功したのです。 トランスジェニック株をさらに確認するために、S8、S10、S14、およびS17株における標的遺伝子の発現レベルをqPCRによって調べました（図5c）。 すべてのモグロシド生合成関連遺伝子は過剰発現されましたが、S10 系統ではすべての遺伝子の発現レベルが比較的高かった（図 5c）。 WT トマト植物では標的遺伝子の転写物は検出されず、モグロシド生合成に関与する 6 つの構造遺伝子がトランスジェニック トマト果実で発現していることが示されました。 すなわち、モグロシド経路をトランスジェニックトマト植物に初めて導入することに成功した。

a Micro-Tom トマトの野生型植物 (WT) およびトランスジェニック トマト植物。 b トランスジェニックトマト果実の PCR に基づく分析。 レーンは左から右に Maker、WT、S8、S10、S14、S17 を表します。 DNA マーカーの画像 (4.5 kb) は図の右下隅にあります。 c トランスジェニックトマト果実における6つのモグロシド生合成遺伝子の相対発現レベル分析。 レアクチンは内部対照として使用されます。 トマト WT 植物の発現を 1 に設定しました。データは平均値 ± SD、n = 3 の生物学的に独立したサンプルとして表示されます。

4 つのトランスジェニック トマト果実におけるモグロシドの生成を、HPLC-ESI-MS/MS によって測定しました。 HPLCの抽出イオンクロマトグラム（EIC）は、トランスジェニックトマト系統S10に少量のMIIIが蓄積していることを示唆し（図6a）、保持時間はモグロシド標準の保持時間と一致しました。 WT植物ではMIIIは検出されませんでした（図6a）。 MIIIの含有量は25.92 ng/g FWであり（図6b）、少量のMI-A1（5.65 ng/g）、MII-E（2.33 ng/g）、SIおよびMVも見つかりました。 ただし、SI と MV の内容は依然として定量限界 (

トランスジェニックトマト果実中のモグロシドの HPLC-ESI-MS/MS 分析。 b トランスジェニックトマト果実における MIII の蓄積。 黒い矢印はモグロシドのピークを示します。 そして、検出されませんでした。 データは平均値 ± SD、n = 3 の生物学的に独立したサンプルとして表示されます。

キュウリは栄養価の高い野菜として知られていますが、味は淡白です。 ポリフェノール化合物と唾液タンパク質はキュウリに微妙な渋みを与えるため、キュウリを食べることを避ける人もいます44,45。 キュウリの風味を改善するために、Siraitia grosvenorii モグロシド生合成遺伝子がキュウリ植物に形質転換され、モグロシド V を含む生殖質が生成されます。また、トランスジェニックキュウリ系統 U1、モグロール、MI-A、MII-E、MIII、および SI の果実では、が見つかり、その含有量はそれぞれ 36.88、58、74.3、615、および 113 ng/g FW でした。 モグロシド IA-1、II-E は苦い味の配糖体であることはよく知られていますが、SI と MV は非常に甘く、MIII は無味またはわずかに甘いため、キュウリを甘くしたり、ブレンドフレーバーにしたり、まったく新しい味を一般的に味わうように栽培します。おなじみの野菜。 また、トランスジェニックキュウリの果実には苦味のあるMI-AおよびMII-Eの含有量が低すぎるため、トランスジェニックキュウリの風味への影響は比較的小さい。 同様に、トマトの形質転換により、トマト中に少量のモグロシド III が生成されました。 トランスジェニックトマト系統では、SI および MV の含有量は依然として定量限界 (

私たちの研究では、形質転換トマト植物の形態学的観察の結果、4つの独立したトマト形質転換系統では重篤な矮化が観察されたが、形質転換キュウリ植物では明らかな形態学的変化は見つからなかったことが明らかになった。 この結果は、モグロシドが植物の成長に影響を及ぼし、トランスジェニックトマト系統に代謝毒性を引き起こす可能性があることを示唆しています。 キュウリに矮化がないことの考えられる説明は、キュウリと Siraitia grosvenorii が両方ともウリ科の植物であり、キュウリ自体にはククルビタシン B やククルビタシン C などのククルビタン トリテルペン サポニンが多く存在し、モグロシドもトリテルペン サポニンであるということです。この場合、トランスジェニックキュウリ系統には毒性効果はありません。 さらに、これまでの研究によれば、ほとんどの研究は、遺伝子組換え工学がジベレリン代謝の代謝障害を引き起こし、それが遺伝子組換えトマト系統の矮小化につながることを証明している52,53。 そして、トランスジェニック遺伝子の挿入は、トランスジェニック植物の成長不良や深刻な矮化を引き起こすことがよくあります。たとえば、以前の研究では、T-DNAをゲノムに組み込むと、他の非特異的遺伝子発現が活性化または不活性化され、生理学的障害や植物抵抗性が引き起こされることが示されています。トランスジェニック植物において 54,55。 したがって、この研究におけるトランスジェニックトマトの矮小化はジベレリン代謝の変化と相関している可能性があると推測しましたが、今後のいくつかの実験でさらに多くの情報が導入される予定です。

多重遺伝子形質転換を使用すると、完全な代謝経路を植物に導入できます。 従来の交雑育種、再形質転換および共形質転換法 56,57 の時間と退屈なステップとは異なり、新たな多重遺伝子ベクター形質転換およびポリシストロン性導入遺伝子には優れた利点があります。 特に、複数のベクター形質転換により、複数の遺伝子発現カセットを単一の T-DNA 領域に構築し、宿主染色体ゲノムに組み込むことが可能になります 57,58。 現在までに、最大数の導入遺伝子を植物に導入できることを示唆する証拠はありませんが、単一ベクターでの 6 つ以上の導入遺伝子の形質転換に関する研究はほとんど行われていません。 さらに、導入遺伝子の数が増加すると、不安定なバイナリーベクターが異種植物で自然発生的な遺伝子損失を誘発する可能性があります 59,60。 したがって、本研究では多重遺伝子ベクターアセンブリの概略設計が重要でした。 Transgene Stacking II システム (TGS II)61,62、Gateway Recombination システム 63,64、Gibson Assembly65,66、および In-fusion 技術 67 は、多重遺伝子ベクターアセンブリに広く使用されています。 このうち、Gateway 組換えシステムは、5 つを超える遺伝子のアセンブリに関して、操作上の困難さのため依然として課題が残っています。 これに基づいて、TGS II は、4 ～ 8 個の遺伝子を異種植物に形質転換するために使用できる、より便利で効率的な多重遺伝子ベクター システムとして最近開発されました 68。 ギブソンアセンブリおよびインフュージョン技術は、単一の反応で複数の重複する DNA フラグメントを同時に融合するために広く使用されています。 また、In-fusion 技術の最大ベクターサイズは 46 kb です。 したがって、In-fusion テクノロジーにより、複数の遺伝子発現カセットのアセンブリが可能になります。 多重遺伝子ベクター内の反復配列を考慮して、自己切断性 2A ペプチド (16 ～ 20 アミノ酸) が導入されました。これにより、他の多重遺伝子発現戦略と比較して比較的高レベルの下流タンパク質発現がもたらされます 69,70,71。 ただし、タンパク質発現の効率は異なる 2A 配列によって媒介されます。 この研究では、SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1、およびSgUGT289-3の転写レベルは、トランスジェニックキュウリの葉と果実で異なっていました。 考えられる理由の 1 つは、導入遺伝子のほとんどが構成的プロモーターである CaMV 35S プロモーターによって駆動され、組織および器官の種類に応じて転写活性に顕著な変動が見られることです 72、73、74、75、76。 CaMV 35S プロモーターが駆動する β-グルクロニダーゼ (GUS) 活性は、カバノキの根と腋芽では他のカバノキ器官よりも高かった 75。 CaMV 35S プロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質 (GFP) は、タバコの葉の維管束組織において他の組織よりも高い活性を示しました 74。 また、生理学的条件や非生物的ストレスも標的導入遺伝子の発現に影響を与えます。 したがって、高い安定した導入遺伝子活性を確保するには、多重遺伝子ベクターの構築と増殖条件にさらに細心の注意を払う必要があります。

要約すると、導入遺伝子スタッキングのための融合ベースの遺伝子スタッキング戦略が開発され、6 つのモグロシド生合成遺伝子がキュウリとトマトに導入され、モグロシド V を含むトランスジェニック甘いキュウリとモグロシド III を含む少し甘いトマトが作製されました。 この研究は、生食用の甘い植物の遺伝的改良における大きな可能性を示しています。 私たちの研究は、甘味品種の伝統的なパターンを根本的に変え、新鮮な野菜の糖分を増やすのではなく、非糖類および非タンパク質の甘味成分を変換するための優れた方法を提供します。 さらに、この研究はモグロシドの異種生合成の可能性を提供します。

Cucumis sativus (JinYan 4、ZY4) および Lycopersicon esculentum (Micro-Tom) を植物の形質転換に使用しました。 一過性発現実験をCucumis sativus ZY4およびタバコで実施した。 この実験では大腸菌株 DH5α および XL10-Gold (WeidiBio、上海、中国) を使用し、形質転換にはアグロバクテリウム ツメファシエンス GV3101 株を使用しました。

適切なプロモーターは、多重遺伝子ベクターで標的遺伝子の発現を駆動するために非常に重要です。 ユビキチン 10 AtUBQ10 およびセリン カルボキシペプチダーゼ様 AtSCPL30 (AtPD7、456 bp) プロモーターを、KOD One PCR Master Mix (TOYOBO CO., LTD., Japan) を使用してシロイヌナズナからクローニングしました。 PCR 条件は次のとおりでした: 98 °C で 5 分間の初期活性化、続いて 98 °C で 10 秒間、アニーリング温度 -5 °C で 5 秒間、および 68 °C で 10 秒/kb で 35 サイクル。最終伸長は68℃で7分間。 AtUBQ10:β-グルクロニダーゼ（GUS）およびAtPD7:GUSベクターを構築するために、これらのプロモーターのそれぞれをXbaI/BamHI制限部位でpBI121プラスミドに融合しました（図1b）。 プライマーは補足表 S2 に記載されています。 得られた組換えプラスミドを配列決定によって確認した。 35S カリフラワー モザイク ウイルス (CaMV 35S) プロモーターによって駆動される pBI121 を、この研究ではポジティブ コントロールとして使用しました。 すべてのプラスミドをアグロバクテリウム ツメファシエンス GV3101 株に形質転換し、Cucumis sativus および Nicotiana benthamiana における一過性アッセイに使用しました。

Siraitia grosvenorii 果実の cDNA を使用して、SgSQE1 (スクアレン エポキシダーゼ)、SgCS (ククルビタジエノール シンターゼ)、SgEPH2 (エポキシド ヒドロラーゼ)、SgP450 (シトクロム P450 モノオキシゲナーゼ)、SgUGT269-1 および SgUGT289-3 (UDP-グルコシルトランス) のコード配列を増幅しました。フェラ）29． すべての遺伝子の発現を開始するために、CaMV 35S プロモーターを pBI121 プラスミドから単離し、AtUBQ10 および AtPD7 プロモーターを KOD One PCR マスター ミックスを使用してシロイヌナズナから増幅しました。 転写ターミネーターに関しては、ノパリンシンターゼ (NOS) ターミネーターは pBI121 から取得し、マンノピンシンターゼ (MAS) ターミネーターと熱ショックタンパク質 (HSP) 18.2 ターミネーターは GENEWIZ (蘇州、中国) によって化学合成されました。

遺伝子アセンブリの最初のラウンドでは、これらのモグロシド生合成関連遺伝子のそれぞれが、Phanta Max Super-Fidelity DNA ポリメラーゼ (Vazyme Biotech Co., Ltd.、南京、中国) を介して増幅され、次に SgCS、SgEPH2、SgP450、および SgUGT289- ClonExpress IIワンステップクローニングキット(Vazyme Biotech Co., Ltd.、南京、中国)を使用して、3をpBI121ベクターのBamHIおよびSacI部位にライゲーションした。 AtPD7プロモーターおよびHSPターミネーターと融合したSgSQE1、およびAtUBQ10プロモーターおよびMASターミネーターと一緒にSgUgt269-1を、ClonExpress MultiSワンステップクローニングキット（Vazyme Biotech Co.、Ltd.、南京、中国）、それぞれ。 PD7:SgSQE1:Thsp、35S:SgCS:Tnos、35S:SgEPH2:Tnos、35S:SgP450:Tnos、35S:SgUGT289-3:Tnos、UBQ10:SgUGT269-1:Tmas が生成されました。 遺伝子アセンブリの 2 回目のラウンドでは、プロモーター、標的遺伝子、ターミネーターを含む最初の遺伝子発現カセットのそれぞれが、KOD One PCR Master Mix を介してクローン化されました。 PD7:SgSQE1:Thsp および 35S:SgCS:Tnos を、ClonExpress MultiS ワン ステップ クローニング キットを介して、pCAMBIA1300 バイナリー プラスミドの EcoRI/HindIII 制限部位に挿入しました。 同様に、UBQ:SgUGT269-1:Tmas および 35S::SgUGT289-3:Tnos を pCAMBIA1300 プラスミドの同じ制限部位に連結し、二重遺伝子発現カセットを生成しました。 遺伝子アセンブリの 3 ラウンド目では、PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos および 35S:SgEPH2:Tnos の領域が PCR によって増幅され、UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289- にサブクローニングされました。 3: pCAMBIA1300 プラスミドの Tnos EcoRI/HindIII 部位。 次に、UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnosおよび35S:SgP450:Tnosの配列を単離し、pCAMBIA1300プラスミドに挿入し、三重遺伝子発現カセットを構築した。 続いて、遺伝子アセンブリの最終ラウンドで、UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos::35S:SgP450 および SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos:: の 6.1 kb 配列が完成しました。 35S:SgEPH2:Tnos (6.5-kb) をトリプル遺伝子発現カセットから単離しました。 最終的な多重遺伝子発現ベクターの場合、上記のフラグメントを、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd.、南京、中国）。 この最終ベクターは、この研究では U22p-SCE ベクターと呼ばれました (補足図 S2a)。 複数遺伝子ベクターの構築に使用されるすべてのプライマーは、補足表 S3 にリストされています。

多重遺伝子発現ベクターを検証し、プロモーター活性を分析するために、Cucumis sativus ZY4 およびタバコで一過性発現アッセイを実行しました。 多重遺伝子発現ベクターを凍結融解法によりアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101株に形質転換した。 形質転換されたアグロバクテリウム株を、細菌のOD600が0.6に達するまで、リファンピシンおよびカナマイシンを補充したLB培地中で28℃で培養した。 すべての培養物を 5000 × g で 10 分間遠心分離し、10 mM 2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸 (MES)、10 mM MgSO4、および 200 μM アセトシリンゴン (AS) を含む緩衝液に再懸濁し、その後 2 分間インキュベートしました。室温で4時間。 この懸濁液を、無針注射器を介して、生後８日のCucumis sativus ZY4植物の子葉およびNicotiana benthamianaの葉（陽性対照）に感染させた。 精度を確保するために、一過性発現手順を独立して 10 回繰り返しました。

以前のプロトコールに従って、GUS 組織化学染色分析のために、ニコチアナ ベンサミアナを浸潤後 48 時間でサンプリングし、Cucumis sativus ZY4 の子葉を 1、3、5、および 7 日目にサンプリングしました 42。 画像はCanon EOS 80Dを使用して撮影されました。 画像を使用して、青色染色の強度を決定しました。 この実験は独立して 10 回繰り返されました。

Cucumis sativus 系統 ZY4 の種子を 55 °C に 15 分間浸し、その後室温に 2 時間放置しました。 キュウリの種子は、Trulson らの方法に従って滅菌されました。 若干の変更を加えたもの77。 浸漬後、種子を 75% アルコールで 30 秒間、続いて 3% NaClO で 15 分間滅菌し、滅菌水で 5 回洗浄し、暗所で Murashige and Skoog (MS) に 3 日間接種しました。 遺伝子組み換えキュウリを取得するために、生後 4 日の Cucumis sativus (キュウリ) の子葉を外植片として使用しました。 子葉を実生から切り取り、成長点を除去した。 外植片を前培養培地、1 mg/L 6-ベンジルアミノプリン (6-BA)、0.5 mg/L アブシジン酸 (ABA) および 2 mg/L AgNO3 を含む MS 培地に暗所で 1 日間配置しました。 次に、外植片を、多重遺伝子発現ベクターを有するアグロバクテリウムに30分間感染させた。 共培養培地 (1 mg/L 6-BA、0.5 mg/L ABA、2 mg/L AgNO3 および 1.45 mg/L AS を含む MS 培地) 上で 25 °C の暗所で 2 日間共培養しました。 共生培養後、外植片を選択培地 (1 mg/L 6-BA、0.5 mg/L ABA、2 mg/L AgNO3、500 mg/L セフォタキシム ナトリウム (Cef) および 5 または 8 mg を含む MS 培地) で培養しました。 /L ハイグロマイシン (Hyg)、18 時間明/6 時間暗条件下)。 Hyg (5 mg/L) を使用して形質転換植物を選択しました。 カルスは、Hyg (8 mg/L) を添加した MS 培地で増殖しました。 一般に、到達したカルスから生じた不定芽は、緑色で健康な外植片に再生されました。 次に、10 mg/L Hyg を添加した発根培地での培養用に、再生体の 2 ～ 3 cm セグメントを選択しました。 1ヶ月の栽培後、再生したキュウリ苗を生体内で切除し、温室で栽培した(図2a)。 その後、継代培養を継続してカルスおよび再生植物を得た。 トランスジェニック系統を得るために、再生植物を発根培地（1 mg/L ジベレリン A3 (GA3)、400 mg/L Cef を含む MS 培地）で培養しました。 再生した植物を、28℃の温室で18時間/6時間(明/暗)下で培養した。

遺伝子形質転換は、Sun et al. に従って行われました。 修正あり78。 Micro-Tom の種子を 70% エタノールで 30 秒間、10% NaClO で 10 分間滅菌し、滅菌水で 4 回洗浄し、滅菌濾紙上で乾燥させました。 種子はMS培地で発芽させた。 生後 10 日の Micro-Tom 植物の葉、子葉、胚軸を外植体として使用し、葉と子葉を約 0.5 cm × 0.5 cm の大きさに切断し、胚軸を約 0.5 ～ 0.6 cm の断片に切断して、外植片として使用します。細菌懸濁液を吸着します。 それらを前培養培地（1 mg/L 6-BA および 0.2 mg/L NAA を含む MS 培地）で 24 時間前培養しました。 前培養後、外植片を多重遺伝子発現ベクターを含むアグロバクテリウムとともに 30 分間インキュベートし、その後共培養培地 (1 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA、および 0.1 mM AS を含む MS 培地) に移し、 2日。 次いで、外植片を選択培地（２．０ｍｇ／Ｌゼアチン（ＺＴ）、０．２ｍｇ／Ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）、１０ｍｇ／Ｌ Ｈｙｇおよび５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン）に移した。 その後、芽を伸長培地 (1.0 mg/L ZT、0.05 mg/L IAA、500 mg/L Cef、10 mg/L Hyg および 500 mg/L カルベニシリン) に移し、再生された芽を成長させました。長さ1cm。 続いて、シュートを、０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡ、２ｍｇ／ＬのＨｙｇ、５００ｍｇ／ＬのＣｅｆおよび５００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む１／２強度のＭＳ培地からなる発根培養培地に移した。

ゲノムDNAは、植物ゲノムDNAキット(Tiangen Biotech Co., Ltd.、北京)を使用してトランスジェニック系統から得た。 KOD One PCR Master Mix を使用したゲノム PCR を実行して、トランスジェニック植物を検証しました。 さらに、ゲノムPCRを使用して、Hyg耐性スクリーニングによって得られたトランスジェニック系統を検出した。 野生型 (WT) 植物ゲノム DNA をネガティブコントロールとして使用しました。 PCR検出に使用されるすべてのプライマーを補足表S4に示します。

CWBIO RNA 抽出キット (CWBIO. Co., Ltd.、北京、中国) を介してトランスジェニック植物の葉から全 RNA を単離し、1 μg の全 RNA を使用して TransScript® One-Step gDNA を介して cDNA を逆転写しました。除去および cDNA 合成 SuperMix (Transgen、北京、中国)。 定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) の場合、PerfectStartTM Green qPCR SuperMix (Transgen、北京、中国) を ABI CFX96TM Real-Time System (米国) と組み合わせて使用​​し、メーカーの指示に従って発現レベルを定量しました。 熱サイクルは次のとおりです。(1) 95 °C で 30 秒。 (2) 95 °C で 3 秒の変性、55 °C で 10 秒のアニーリングを 40 サイクル。 (3) 95 °C で 15 秒のインキュベーション、60 °C で 60 秒のインキュベーション、95 °C までの昇温からなる解離曲線。 遺伝子転写レベルは、2-ΔΔCT 法を使用して標的遺伝子発現について正確に定量化され、Csactin および Leactin が内部対照として使用されました。 この実験は複数の技術的複製に対して実施されました。 qRT-PCR に使用されるすべてのプライマーは補足表 S5 にリストされています。

すべてのサンプルを液体窒素中で粉砕し（キュウリ、10 g、トマト、4 g）、それぞれ 10 mL および 4 mL の 80% メタノール溶液中で均質化しました。 次に、超音波ウォーターバス支援抽出を室温、40 kHz で 1 時間実行し、5000 × g で 20 分間遠心分離しました。 その後、上清を収集し、0.22 μM Millipore フィルターを使用して濾過しました。

モグロシドおよびモグロール含有量の定量分析には、Agilent Poroshell 120 SB C18 カラムを備えた AB SCIEX QTRAP 4500 LC-MS/MS (AB SCIEX、トロント、カナダ) システムおよび Agilent Technologies 1260 シリーズ LC システム (Agilent、米国) （100mm×2.1mm、2.7μm）を使用しました。 移動相は、(A) 水 (0.1% ギ酸を含む) および (B) アセトニトリル (0.1% ギ酸を含む) から構成され、勾配溶離を行いました。 モグロシドの HPLC 条件は次のとおりでした: 0 分、20% B; 3 ～ 5 分、23% B。 18 分、40% B; 流量は 0.25 mL/min でした。 モグロールの場合、HPLC 条件は次のとおりです。0 分、20% B。 0.5 分 30% B; 2 ～ 4 分、88% B。 HPLC-ESI-MS/MS パラメーターを表 1 に示します。この研究では、エレクトロスプレー イオン化 (ESI) と多重反応モニタリング (MRM) スキャンを使用しました。 各実験は 3 回実行されました。 上記 2 つの手法は以前の研究で定量分析用に開発されたものであり、本研究では対象成分を正確に定量するのに適しています。 定量分析は外部標準法を使用して実行されました79,80。

モグロシド I-A1 (MI-A1)、モグロシド II-E (MII-E)、モグロシド III (MIII)、シアメノシド I (SI)、モグロシド V (MV)、およびモグロールを含むすべての標準物質は Chengdu Must Bio-Technology から購入しました。有限公司（中国四川省）をメタノールに溶解した。

トランスジェニック植物における代謝産物を同定するために、ネガティブエレクトロスプレーイオン化（ESI）を備えたUPLC-ESI-QTOF-MS/MSシステム（Waters Corp.）によって分析した。 MS 条件は MSE 連続モードで、スキャン範囲は m/z 100 ～ 1500 でした。衝突電圧は 2.5 KV でした。 サンプリングコーン電圧とエクストラクター電圧はそれぞれ 40 KV と 4 KV でした。 ソース温度と脱溶媒和温度はそれぞれ 100 °C と 250 °C でした。 コーンガス流量は 50 L/hr、脱溶媒和ガス流量は 600 L/hr でした。 MS/MS データを収集するために、衝突エネルギーを 15 eV から 45 eV に増加させました。 Masslynx 4.1 ソフトウェアをデータの取得と処理に使用しました。

リアルタイム定量分析データは、論文中で少なくとも 3 回の独立した実験の平均値 ± SEM として示されています。 特に明記しない限り、すべてのサンプルはランダムに取得され、すべての独立したサンプルまたは実験は 3 回以上繰り返されました。 平均値と標準偏差は、SPSS 16.0 統計プログラム (IBM Co.、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用して計算されました。 すべてのプロットは、Origin 2019b (OriginLab Co.、ノーサンプトン、マサチューセッツ州、米国) を使用して取得されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

未処理のブロット画像を補足図S7に示します。 図のソース データは補足データ 1 で入手できます。このプラスミド Up-SCE は、Addgene カタログ # 197269 から入手できます。他のすべての関連データは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (U20A2004; 81973413; 82104548)、CAMS 医療科学イノベーション基金 (CIFMS) (2019-1007-15; 2021-I2M-1-071)、および科学広西チワン族自治区のテクノロジー主要プロジェクト (GuiKeAA19254025)。

リャオ・ジンジン

現在の住所：アルテミシニン研究センター、中国医学科学院、中国医学研究所、北京、100700、中国

薬用植物開発研究所、中国医学科学院および北京連合医科大学、北京、100193、中国

Jingjing Liao、Lei Xie、Jing Qiao、Shengrong Cui、Xunli Jia、Zuriang Luo、Xiaojun Ma

瀋陽農業大学園芸学部、瀋陽、110866、中国

リュウ・ティンヤオ

広西省作物遺伝子改良およびバイオテクノロジー研究所、広西省農業科学アカデミー、南寧市、530007、中国

モー・チャンミン

植物機能性植物化学と持続可能な利用の広西重要研究室、広西チワン族自治区および中国科学院、広西植物研究所、桂林、541006、中国

黄西陽

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JL、XM、JQ がこの研究を考案しました。 JL、TL、LXは多重遺伝子ベクターを構築しました。 JL、CM、および XH は植物形質転換アッセイを実施しました。 SC、JL、およびXJは、PCR検出およびqRT-PCR分析を実行しました。 ZL はトランスジェニック植物中のモグロシド成分を検出しました。 XMがプロジェクトを監修しました。 JL が原稿を書きました。 XM、ZL、TL が原稿を修正しました。

Zuliang Luo または Xiaojun Ma への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読への貢献に対して、Oswaldo Hernandez-Hernandez、Ana Munoz、および Yoshihiko NanaSat に感謝します。 主な編集者: Leena Tripathi と Joao Valente。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Liao、J.、Liu、T.、Xie、L. 他。 遺伝子操作によるキュウリとトマトにおける異種モグロシドの生合成。 Commun Biol 6、191 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04553-3

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受信日: 2022 年 5 月 22 日

受理日: 2023 年 2 月 3 日

公開日: 2023 年 2 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04553-3

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