シクロデキストリンカルボキシレートは、幅広い適用条件におけるナイシンの安定性と活性を向上させます。

npj Scienze dell'alimentazione Volume 7,

npj 食の科学第 7 巻、記事番号: 20 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ナイシンは、グラム陽性菌に対して優れた抗菌活性を示す天然のバクテリオシンです。ナイシンは酸性条件下で良好な溶解性、安定性、活性を有しますが、溶液のpHが6.0を超えると溶解性、安定性、活性が低下し、抗菌剤としてのナイシンの工業的応用範囲が大幅に制限されました。この研究では、この欠点を克服するために、ナイシンとシクロデキストリンカルボキシレート、コハク酸-β-シクロデキストリン（SACD）との複合体形成の可能性を調査しました。ナイシンと SACD の間に強い水素結合が見られ、ナイシン - SACD 複合体の形成が促進されました。これらの複合体は、中性およびアルカリ性条件下で良好な溶解性を示し、高蒸気滅菌処理中に高い pH 値に保持された後も良好な安定性を示しました。さらに、ナイシン-SACD複合体は、モデルグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌）に対して抗菌活性が大幅に向上したことを示しました。この研究は、錯体形成により中性およびアルカリ性の状況下でナイシンの有効性が向上する可能性があることを示しており、これにより食品、医療、その他の産業におけるナイシンの適用範囲が大幅に広がる可能性があります。

ナイシンは、ラクトコッカスラクティス亜種株によって産生される 34 アミノ酸残基で構成される小さなペプチドであり、食品保存料として承認されている唯一のバクテリオシンです1。一般に安全であると認められており（GRAS）、食品、医療、農業業界で広く使用されています。ナイシンはグラム陽性菌に対して広範囲の抗菌活性を示します。細菌の細胞膜に吸着して細胞膜を破壊し、細胞内物質の放出を引き起こし、細胞死を促進すると考えられています2,3。酸性条件下 (pH < 6.0) では、ナイシンは望ましい溶解性と安定性を示し、熱処理後の活性の損失はわずかです 4,5。しかし、ナイシンの構造はアルカリ条件下では分子間求核付加反応により変化し、その結果、水溶性、熱安定性、抗菌活性が低下します6,7。したがって、天然抗菌剤としてのナイシンの工業的応用は、現在、酸性条件に限定されている。

細胞内液、細胞外液、腸液など、ほとんどの生理液の pH は 6.0 ～ 8.5 の範囲にあります8。したがって、ナイシンの産業用途を拡張するために、生理学的状況下でナイシンの溶解性、安定性、抗菌活性を維持するための戦略を特定することに努力が注がれてきました。有機酸は水溶液中で水素結合を通じてナイシンと会合することができ、これによりナイシンの性能が向上する可能性があります。たとえば、Adhikari ら。図７は、ナイシン−有機酸複合体が、ｐＨ８．０において純粋なナイシンよりもはるかに高い抗菌活性を有することを示した。ナイシンと EDTA を組み合わせて使用すると、ナイシン 9 の抗菌活性が増加することも示されており、これはキレート剤の細菌細胞壁の透過性を高める能力によるものと考えられます。しかし、ナイシンの安定性には明らかな改善はありませんでした。ナイシンの安定性を向上させることを目的とした他の取り組みは、通常、キトサン、セルロース、ペクチンなどの生体高分子から調製されたナノ送達システムに依存しています3,10,11。しかし、これらの送達システムの構築は多くの場合複雑でコストがかかり、スケールアップが難しいため、産業上の応用が制限されます。したがって、実際の産業上の要件を満たすことができる簡単で安価な方法を開発することが有利である。

シクロデキストリン (CD) は、さまざまな数の α-D-グルコピラノース単位で構成される環状オリゴ糖で、酵素加水分解によってデンプンから生成され、世界のほとんどの地域で食品および健康製品への使用が認可されています12。 CD の環状の性質により、疎水性のコアと親水性の外側を持つ分子が生成され、非極性のゲスト分子または部分を組み込むためのホスト分子として適しています 13。多くの場合、CD に生理活性化合物をカプセル化すると、その水分散性が向上し、熱、光、酸素に対する耐性が強化され、放出の制御が可能になります 14,15。これまでに研究者らは、β-CD 内にナイシンをカプセル化すると、調理済み豚肉の保存中の抗菌活性が向上することを示しており 16、これはナイシンの微小環境を変化させるナイシン - CD 複合体の形成によるものであると考えられています。しかし、ナイシンの溶解性、安定性、抗菌活性を同時に高めることができる別の形態のCDが依然として必要とされています。

β-CD は、食品業界で一般的に使用されているシクロデキストリンの中でも、低コストで疎水性ゲスト物質に対して強い結合親和性を示します。しかし、その水溶解度 (約 1.85%) は、多くの商業用途には不十分です 17。したがって、実際のシステムでは、ナイシンの溶解度を高めるために使用されるβ-CD の用量が制限されました。ヒドロキシプロピル-β-CD (HP-β-CD)、スルホブチルエーテル-β-CD (SBE-β-CD)、メチル-β-CD (M-β-CD) など、商業医薬品用途で広く使用されている β-CD 誘導体）化学修飾後、水分散性が大幅に改善されたことが示されています17、18。食品グレードのシクロデキストリン誘導体を作成するための新しい戦略も検討されています。例えば、オクテニルおよびオクタデセニルコハク酸無水物は、シクロデキストリン分子上のヒドロキシル基に結合して、良好な乳化特性を有する誘導体を生成している19,20。ただし、β-CD に対するこのような大きな置換基は、立体障害効果によりゲスト分子を組み込む能力に影響を与える可能性があります。我々の以前の研究では、シクロデキストリン誘導体であるコハク酸-β-シクロデキストリン（SACD）が得られ、β-CDよりも50倍以上水分散性が高いことが示されました。一方、SACD はゲスト分子に対して著しく高い錯体形成挙動を示します 21。この変更は、使用されたすべての化学薬品が食品グレードであり、シンプルかつ安全な化学乾熱手順に従って行われました。得られた SACD は非細胞毒性であることが実証されており、これはナイシンの溶解性と生物活性を改善するための有望な戦略となる可能性があります。

本研究では、SACDと複合体を形成することでナイシンの溶解性と抗菌活性を向上させることを目的としました。ナイシンと SACD の間の分子相互作用は、複合体の分子構造と結晶構造を分析することによって解明されました。ナイシン-SACD複合体の水溶性と安定性を測定した。さらに、モデルグラム陽性食品由来病原体（黄色ブドウ球菌）に対するナイシン-SACD複合体の抗菌活性が解明されました。

ナイシン-SACD複合体の形成を促進するナイシンとSACDの間の相互作用を明らかにするために、FTIR分析を使用して、複合体化ナイシン-SACDとナイシン、SACD、およびナイシンとSACDの物理的混合物（PMナイシン+）の化学的特性を比較しました。 SACD）（図1a）。ナイシンと SACD の間の分子相互作用は FTIR スペクトルから示されました。 3369 cm-1 付近の幅広いピークは、SACD 分子の O-H 伸縮振動に起因すると考えられます。 1732 cm-1 のピークは、SACD のエステル結合の C=O 伸縮に起因すると考えられました。 2929、1155、および1027 cm-1の特徴的なバンドは、それぞれSACDのCH2、C-O-C、およびC-OH基に起因していました。 3440 cm-1 のナイシンの広いピーク吸収バンドは軸方向の O-H/N-H 伸縮振動に起因し、2923 cm-1 のバンドは C-H の伸縮振動に起因し、1630 付近のバンドはcm-1 はアミド基による吸収に起因すると考えられます 22。 SACDと複合体を形成した後、O-HおよびNH-Hに対応するバンドはより低い波数（3269 cm-1）に大幅にシフトし、SACDおよびナイシンと比較してそれぞれ-127および-171 cm-1の波数シフトがありました。。一方、ナイシン-SACDのエステルC=Oバンドでは10cm-1の赤方偏移が1722cm-1で観察された。上記の現象は、ナイシンとSACDの間に強い水素結合が起こったことを示しています。おそらく、SACD 分子上のコハク酸分岐がこれらの相互作用において重要な役割を果たしたと考えられます。他の研究者も、錯体中の同様の成分間の強い水素結合を報告しています 23,24。アミドバンドはナイシン-SACD複合体のスペクトルでは観察されなかったが、これは複合体中のナイシンの割合が比較的低いため、SACDの遮蔽効果の結果である可能性がある。ナイシン + SACD の物理的混合物の FTIR スペクトルは、2 つの個別の成分の組み合わせと一致しており、明らかなバンドシフトは観察されませんでした。これらの結果は、ナイシンと SACD の単純な物理的混合物では複合体形成が起こらなかったことを示唆しています。

SACD、ナイシン、ナイシン-SACD、およびナイシンとSACDの物理的混合物（PMナイシン+SACD）のFTIR（a）およびXRD（b）スペクトル。

生理活性物質の生物学的利用能は、マトリックス中の生理活性物質の分散度と直接相関していることが知られています。製薬業界では、生理活性物質を結晶状態から非晶質状態に物理的に変換することは、マトリックス中の生理活性物質の分散性を改善する効果的な方法とみなされています。以前の研究では、CD は栄養補助食品や医薬品を含む多くの疎水性生物活性化合物と頻繁に複合体を形成していました。錯体形成後、生理活性化合物の物理的状態は結晶構造から非晶質形態に変換され、溶解度が大幅に向上し、化合物の生物学的利用能と生物活性が効果的に強化されました 26、27、28。したがって、本研究では、ナイシン-SACD複合体の活性を予測するために、SACDと複合体を形成した後、X線回折装置を使用してナイシンの結晶構造を分析した。ナイシンは、27.4°および 31.7°の 2θ 値で回折ピークを示しました (図 1b)。これは以前の研究と一致しています 29。 SACD では明確な回折ピークは観察されず、SACD が非晶質構造であることを示唆しています 21。ナイシンとSACDの複合体形成後にはわずかな変化のみが観察され、ナイシンがナイシン-SACD複合体中に非晶質形態で存在することが示唆された。したがって、我々は、ナイシン-SACD複合体の非晶質な性質がナイシンの生物学的活性を増加させるのではないかと推測した。比較として、ナイシン + SACD の物理的混合物は、ナイシンの鋭い結晶ピークを含む、ナイシンと SACD の回折パターンの単純な組み合わせを示しました。これらの結果は、ナイシンが物理的混合物中で結晶形態のままであることを示しており、これはナイシン-SACD複合体の形成が成功していることをさらに実証している。

ナイシンと SACD の複合体形成により、ナイシンの分子配置と相互作用に変化が生じ、その熱安定性に影響を与える可能性があります。したがって、制御された加熱中のナイシン-SACD 複合体および混合物の質量変化挙動を評価するために、熱重量分析を実行しました。一般に、100 °C 未満で観察された第 1 段階の重量損失は、サンプル内の水分の蒸発に起因すると考えられます。図2aに示すように、100℃未満の初期段階ではナイシンの明らかな重量損失はありませんでした。これは、中性pHでの親水性が低いため、粉末ナイシンにほとんど水が捕捉されていないことを示唆しています。さらに、加熱プロセス (600 °C) の終了までにナイシンの重量損失はわずか (<7%) しか観察されませんでしたが、これはナイシンの結晶化度が高いためである可能性があります。他の研究者は、乾熱条件下でのナイシンの同様の安定性を報告しています30。

ナイシン、ナイシン-SACD、PM ナイシン + SACD、および SACD の TG (a) および dTG (b) 曲線。

SACD の場合、加熱中の質量損失の 2 つの異なる段階が TG 曲線で観察されました。最初の段階は、SACD の親水性構造に捕捉された水分子の存在による水分の蒸発によるもので、総重量損失の約 4.5% に寄与しました。加熱の終了時には、このサンプルでは重量損失の約 67% が発生していました。これは主に、約 300 °C 以上での SACD 分子の熱劣化によるものでした。

ナイシン-SACD 複合体の場合、加熱の最初の段階での水分損失は純粋な SACD よりわずかに少なかった。これは、SACD 上の一定量のヒドロキシル基とカルボキシル基がナイシンによって占有されており、したがって水分子が利用できないためである可能性がある。に吸着する。また、300 °C 付近で質量が急激に減少しましたが、これは主に SACD の熱劣化に起因すると考えられます。より高い温度では、熱分解速度は純粋なSACDよりもナイシン-SACD複合体の方が速かったが、これは分子力が弱かったためである可能性がある。

ナイシン-SACD 複合体と比較して、加熱プロセスの終了時におけるナイシンと SACD の物理的混合物の重量損失は少ないことが示されました。これはフリーナイシン部分が結晶構造の安定性が高いためと考えられます。これは、サンプルの乾熱安定性がナイシン-SACD 複合体における特異的な分子間反応を反映し、証明されたことを示唆しています。しかし、質量損失がわずかであってもペプチド構造の変化が起こる可能性があるため、結果はナイシンの生物学的活性と直接相関しませんでした 31。

乾熱プロセスをよりよく理解するために、サンプルの質量変化率曲線を TG 曲線から計算しました (図 2b)。最も速い熱劣化が起こった温度は、得られた dTG プロファイルで容易に観察できます。ナイシンの最大分解ピークは 333 °C で発生しました。これは、少量の弱く結晶化したナイシンがこの温度で分解したことを示唆しています。 SACD の最大分解ピークは 326 °C で発生し、この物質の大部分はこの温度で分解されます。ナイシン-SACD 複合体の場合、317 °C という低い分解温度が観察されました。これは、非晶質構造内に存在する分子力が弱いことと一致しています。興味深いことに、ナイシン-SACD 複合体では約 504 °C で幅広いピークが観察されました。これは、複合体中の SACD の進行性の熱分解によるものと考えられます。ナイシンと SACD の物理的混合物は約 337 °C で最大分解速度を示しましたが、これは SACD の熱劣化によるものと考えられます。

ナイシンと SACD の溶解性と錯体形成挙動を、UV-vis スペクトル分析によって調査しました (図 3)。純粋なナイシンの最大吸光度は約 201 nm で発生し、これはそのペプチド骨格の二次構造に関連しています 32。しかし、ナイシン濃度が低すぎたため、このピークは UV スペクトルでは観察できませんでした。 SACD の場合、280 nm でピークが観察されました。これは、SACD 分子上の不飽和分岐の吸収に関連している可能性があります 33。 SACD と複合体を形成した後、水溶液中のナイシンの吸光度は SACD 濃度の増加とともに大幅に増加しました。これは、ナイシンの溶解度が徐々に向上していることを示唆しています。一般に、ナイシンは酸性条件下で可溶性であると認識されていた。ナイシンの溶解度は、pH 2.0でのSACDによっても大幅に増加することが観察され（図3a）、ナイシンの微小環境変化の発生を示唆しています。最大吸光度波長は、SACD 濃度の増加とともに 201 nm から 204 nm に徐々にシフトしました。このような赤方偏移現象は、ナイシンと SACD の間の疎水性相互作用力の増加を示しており、これがナイシンの環境非極性の強化に寄与しています 16。 pHが5.8に増加すると、溶液中のナイシンの吸光度は同じSACD濃度でより高い値を示しました（図3b）。ナイシンの最大吸光度は、SACD 濃度が増加するにつれて徐々に 207 nm まで赤方偏移しました。これらの結果は、pH が増加するにつれてナイシンと SACD の複合体形成が強くなることを示唆しています。 2 つの成分間のより強い相互作用は、ナイシンの可溶化にあまり有利ではない条件として知られている pH 7.4 および 8.0 で観察できました5。 211 nm までのさらに大きな赤方偏移現象が両方のアルカリ性状況で示されました (図 3c、d)。ナイシンの最大吸光度はわずかに低下しましたが、ナイシンの溶解度は 2 つのアルカリ性状況において純粋なナイシンと比較して依然として高いレベルを維持しました。

pH 2.0 (a)、pH 5.8 (b)、pH 7.4 (c)、および pH におけるさまざまな濃度の SACD (2、4、6、8、および 10 mg/mL) を含むナイシン SACD の紫外可視スペクトル8.0(d); pH 2.0 (e)、pH 5.8 (f)、pH 7.4 (g)、および pH 8.0 (h) におけるナイシン-SACD の溶解度フィッティング曲線。そして、pH 2.0 (i)、pH 5.8 (j)、pH 7.4 (k)、および pH 8.0 (l) における、遊離ナイシンおよび SACD、HPCD、CD との複合ナイシンの紫外可視スペクトル。

SACD 溶液中のナイシンの溶解度曲線は、さまざまな pH 値でプロットされました (図 3e-h)。 pH 2.0 では、SACD 濃度の上昇に伴ってナイシンの吸光度が直線的に増加しました。 pH 2.0 の下でのナイシンの相対的な親水性は、複合体形成溶液中に存在する可溶化されたナイシンの量が多いため、SACD と複合体を形成するのに有利である可能性があります。 5.8、7.4、および 8.0 のより高い pH では、SACD 溶液中のナイシンの溶解度について非線形の近似曲線が観察されました。この効果は、ナイシンに起こった分子間求核付加反応に起因すると考えられ、アルカリ性 pH34 でのナイシンの溶解度が低下しました。幸いなことに、SACD は、相対的なアルカリ性条件下でナイシンの望ましくない変換を妨げ、適用された pH 範囲でナイシンに可溶性を与える満足のいく効果を示しました。

ナイシンの適用範囲を広げるSACDの有効性を区別するために、SACDおよび2つの一般的に使用されるCD、β-CDおよびHP-β-CDとナイシンの複合体形成挙動をさらに比較しました（図3i-l）。 β-CD と HP-β-CD はどちらも、ナイシンの溶解度が大幅に向上しています。最大吸光度における波長の明らかな赤方偏移は、相対アルカリ性条件で観察された（例えば、HP-β-CD 溶液中のナイシンの最大吸光度は、pH 8.0 で 205 nm に現れた）。測定された 4 つの pH 状況において、HP-β-CD を含む溶液中のナイシンの吸光度は、β-CD を含む溶液よりも高かった。しかし、SACD 溶液中のナイシンの最大吸光度値は、β-CD または HP-β-CD 溶液中のナイシンの値をはるかに超えていました。したがって、SACD は中性およびアルカリ性の状況でナイシンの溶解性を促進する点でいくつかの利点を示したと結論付けることができます。これらの結果は、ナイシンと SACD を複合化すると水分散性が大幅に向上する可能性があることを示しており、これはさまざまな産業でナイシンをより広範に利用するのに有益であると考えられます。

異なる pH 値でのナイシン - SACD 複合体の安定性は、0 日および 10 日間の保存後の溶液中の可溶化ナイシンを測定することによって評価されました。保持指数 (RI) はこのデータから計算され、さまざまな複合体におけるナイシンの安定性を示すために使用されました (図 4)。すべてのサンプルは 10 日間保存した後でも良好な安定性を示し、RI 値は 100% を超えていました。この結果は、調査したすべての pH 値で複合体形成によりナイシンを安定化できたこと、および複合体の形成が比較的ゆっくりであった可能性があることを示唆しています。注目すべきことに、低濃度のSACDを含む複合体中のナイシンのRI値は、高濃度のSACDを含む複合体よりもかなり高かった。以前の研究によると、FTIR 分析で示されているように、1 つの SACD 分子には複数のエステル分岐があり、ナイシンに結合することができます 21。比較的無秩序な分子構造を持つペプチドであるため、ナイシンは比較的小さな SACD 分子と完全に複合体を形成することが困難です。ナイシンが伸長して SACD 分子表面の空いている部位を見つけるには時間がかかります。より多くの SACD がシステムに含まれると、ナイシンの RI の増加はより少なく観察されました。それは、SACD に結合できるナイシン分子上の遊離部位が少なかったためである可能性があります。

pH 2.0、5.8、7.4、および8.0で10日間保持した後の、さまざまなSACD濃度(2、4、6、8、および10 mg/mL)でのナイシン-SACD複合体の保持指数(RI)。エラーバーは、同じサンプルの 3 回のテストからの標準偏差を表します。

製剤の熱安定性は工業用途にとって重要であるため、高温蒸気滅菌に対するナイシン-SACD 複合体の耐性が測定されました。これまでの研究では、ナイシンが熱処理されると化学分解が起こり 34、抗菌活性が低下することが示されています 3,35。 SACDと複合体を形成した後、研究したどのpHでもナイシンの熱分解は観察されず、熱処理後の可溶化ナイシンの量はかなり増加しました(図5)。これらの効果は、低濃度の SACD (2 mg/mL) を含む複合体で最も顕著であり、滅菌していないものと比較して 2 倍を超える可溶化ナイシンを示しました。可溶化効果は、より高い pH 値でより顕著になり、熱処理後に 2 mg/mL SACD 溶液中で最大 3 倍多くのナイシンが可溶化されました。複合体形成プロセス中により多くのSACD分子が存在すると、ナイシンの可溶化に対する高温の促進が減少するように見えました。これは、ナイシンとSACDの間の複合体の飽和が徐々にしか起こらなかったためである可能性があります。それでも、SACD 濃度 10 mg/mL では、ナイシンの RI 値のかなりの増加 (>120%) が依然として観察されました。以前の研究では、ナイシンとアラビアゴムおよびペクチンの複合体形成により、ナイシンが 121 °C での熱分解から保護されましたが、ナイシンの溶解度は改善されませんでした 1,3。これらの結果は、SACD との複合体形成がナイシンの熱安定性を増加させるだけでなく、加熱中の可溶化も増加させることを示唆しています。

121℃で30分間処理した後の、異なるSACD濃度(2、4、6、8、および10mg/mL)およびpH(2.0、5.8、7.4、および8.0)の状況におけるナイシン-SACD複合体のRI。エラーバーは、同じサンプルの 3 回のテストからの標準偏差を表します。

最後に、本研究で開発したナイシン-SACD複合体の黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を測定しました。黄色ブドウ球菌は、静菌剤の抗菌効果を予測するためのモデルグラム陽性菌として一般的に使用されます。一方、胃腸炎、下痢、嘔吐を引き起こす食中毒の重大な原因でもあります36。肉、卵、乳製品などの黄色ブドウ球菌中毒の影響を受けやすい食品37。ナイシンは細胞膜に吸着し、細胞膜を破壊し、必須の細胞内成分の損失を促進することにより細菌を不活性化できることが知られています 38。図6aに示すように、純粋なナイシンは使用した条件下で中程度の抗菌活性のみを示し、細菌懸濁液のOD600値は1.23から0.46（2.7倍）に減少しました。ナイシン-SACD複合体で処理した後の細菌の細胞膜の変化を観察するために、処理した細菌の表面微細構造をSEM画像を収集することによって観察しました（図6b）。細菌の外観は球体から不定形に変化し、細胞膜が破壊されたことを証明しました。対照的に、ナイシン-SACD 複合体ははるかに強力な抗菌活性を示し、OD600 値は 0.04 (31 分の 1) に減少しました。ナイシン-SACD複合体で処理した培養物のコレクションのSEM画像では、細胞様構造はほとんど観察できませんでした。この抗菌活性の増加は、複合体中のナイシンの溶解度および化学的安定性の増加に起因すると考えられます。さらに、複合体の殺菌効果の増加は、SACD の何らかの抗菌活性によるものである可能性もあります。 SACD の表面にはカルボキシル基が含まれており、細菌の周囲により酸性の微環境を作り出し、細菌の増殖を妨げる可能性があります 27,39。我々の以前の研究では、比較的高用量の純粋なSACDは、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を確かに示した27。したがって、我々の結果は、SACD の存在がナイシンの溶解性と活性を増加させる複合体を形成することにより、ナイシンの抗菌効果を改善したことを示唆しています。

無処理の細菌培養物と、SACD、ナイシン、およびナイシン-SACD 複合体で処理した細菌培養物の OD600 値 (a)。ブランク、SACD、ナイシン、およびナイシン-SACD複合体サンプルの培養物から収集された黄色ブドウ球菌のSEM画像(b)。ブランク、SACD、ナイシン、およびナイシン-SACD複合体サンプルで処理した黄色ブドウ球菌培養物中の生菌/死菌の蛍光強度(c)。エラーバーは、同じサンプルの 3 回のテストからの標準偏差を表します。

ナイシン-SACD 複合体の実際の応用をサポートするために、ナイシン-SACD および HSS-ナイシン-SACD の最小発育阻止濃度 (MIC) が決定されました。 2 つの複合体は、黄色ブドウ球菌に対してそれぞれ 20 mg/mL および 40 mg/mL の MIC を有しました。しかし、ナイシンと SACD を単独で使用した場合の設定濃度範囲では、有意な抗菌効果は観察されませんでした。 HSS-ナイシン-SACDではより高いMICが観察されましたが、SACDとの複合体形成は、高温処理後のナイシンの生物学的活性の顕著な保護と保存を示しています。細菌をMICレベルのナイシン-SACDまたはHSS-ナイシン-SACDで処理した後、全細菌と死菌の両方が未処理グループと比較して低レベルで存在しました（図6c）。これは細菌の増殖が効果的に阻止されたことを示しています。先に実証したように、細菌培養物をナイシンまたはSACDで単純に処理することによって、細菌増殖に対するある程度の阻害が観察された。この結果は、ナイシンとSACDの間の複合体形成が相乗効果を示し、ナイシンとSACDの生物学的活性を有意に増強することを再度確認した。同様の相乗効果がナイシンとカルバクロールの間に存在することが、Li et al.によって報告された。 40.

この研究では、SACD を使用して分子複合体を形成することでナイシンの溶解性、安定性、抗菌活性を改善しました。 FTIR スペクトルで観察される特定のピークのかなりの赤方偏移により、ナイシンと SACD 分子の間に強い相互作用があると推測されました。ナイシンの高度に結晶化された分子構造は、ナイシン-SACD複合体形成後に非晶質構造に変換されました。純粋なナイシンよりも複合体の分子相互作用が弱いため、全体的な熱安定性が低下しました。それにもかかわらず、複合体内のナイシンは、高温での分解に対して安定なままであるようでした。紫外可視分光法は、ナイシンとSACDの間の相互作用が周囲の溶液のpHに依存し、より高いpH値でより強い相互作用が起こることを示唆しました。これらの結果は、ナイシンと SACD の複合体形成により、中性およびアルカリ性の状況下での溶解性、安定性、および活性が向上する可能性があることを示唆しています。さらに、錯体形成により、高蒸気滅菌に対するナイシンの耐性が向上しました。最後に、ナイシン-SACD 複合体および HSS-ナイシン-SACD 複合体の抗菌活性は、モデルグラム陽性菌 (黄色ブドウ球菌) に対して純粋なナイシンよりもはるかに効果的であることが示されました。全体として、我々の結果は、ナイシンと SACD の複合体形成には、食品または医薬品製剤における抗菌剤としての利用を改善する大きな可能性があることを示しています。将来的には、これらの複合体の安全性と有効性を評価するために、インビトロおよびインビボ研究が必要となります。さらに、実用化に向けて広く利用されるには、法的ハードルや規模拡大のハードルを乗り越える必要がある。

Streptococcus lactis 由来のナイシン、β-シクロデキストリン (≥99.5%、β-CD)、コハク酸 (SA)、および次亜リン酸ナトリウム (SHP) は、Aladdin Regent Co. (上海、中国) から購入しました。他の化学物質は分析グレードのものでした。すべての実験で水溶液を調製するために脱イオン水を使用しました。

SACD は、以前の研究で説明した方法を使用して作成されました 21。簡単に説明すると、4.00 gのβ-CD、2.96 gのSA、4.00 gのSHP、および40 mLの脱イオン水が混合され、完全に溶解するまで撹拌された。混合溶液を円板（直径 160 mm）に注いだ後、サンプルを 100 °C のオーブンで 3 ～ 5 時間乾燥させました。次に、プレートを 140 °C に設定した別のオーブンに移し、20 分間保持してエステル化反応を発生させました。エステル化サンプルを室温まで冷却した後(約0.5時間)、粗生成物をまず20 mLの脱イオン水に可溶化し、次いで過剰量の無水エタノールを加えて沈殿させることによって収集した。この洗浄プロセスをさらに 2 ～ 3 回繰り返して、最終製品に不純物が残らないようにしました。その後、サンプルを一晩乾燥させてエタノールを除去し、最終生成物を収集した。

１ｍｇのナイシンを１０ｍＬのＳＡＣＤ溶液（４００ｍｇ／ｍＬ）内に可溶化することによって、ナイシンをＳＡＣＤと複合体化した。よく混合した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、不溶物を除去した。上清を収集し、凍結乾燥して固体状態評価用の粉末形態に変換しました。

SACD 溶液中のナイシンの溶解度に対する pH の影響を評価しました。 SACD 濃度が 0、2、4、6、8、および 10 mg/mL の溶液は、SACD をさまざまな pH 値の緩衝液に可溶化することによって調製されました。得られたサンプルを、それぞれ遊離ナイシン、ナイシン-SACD2、ナイシン-SACD4、ナイシン-SACD6、ナイシン-SACD8、およびナイシン-SACD10と呼びます。 HClを使用してpHを2.0に調整する場合を除き、リン酸緩衝液を使用して異なるpH値(5.8、7.4、および8.0)を調製しました。次いで、１ｍｇのナイシンを、異なるｐＨ値を有する上記のＳＡＣＤ溶液に添加した。 SACD 濃度は、各 pH 値で 2 ～ 10 mg/mL の範囲でした。得られた懸濁液を２５℃で８時間撹拌して、ナイシンを飽和可溶化させた。孔径 0.45 μm のフィルターを通過させて未溶解物質を除去した後、可溶化されたナイシンの量を紫外可視分光光度計 (UV-1800PC、マパダ、中国) を使用して 201 nm で定量しました。ナイシンとSACDの間のホスト-ゲスト相互作用は、SACDと複合体を形成した後のナイシンの最大吸光度の波長シフトから観察できた。次に、吸光度を SACD 濃度の関数としてプロットすることにより、さまざまな pH 値での SACD 溶液中のナイシンの溶解度曲線を構築しました。ナイシン-SACD の有効性を証明するために、10 mg/mL のβ-CD および 10 mg/mL の HP-β-CD と複合体化したナイシンを使用する追加の対照グループを pH 7.4 で調製しました。サンプルは、それぞれナイシン-CD10 およびナイシン-HPCD10 と呼ばれます。複合溶液を調製するために使用される他のすべての手順は、ナイシン-SACD サンプルの場合と同じでした。

粉末サンプルの赤外スペクトルは、FTIR 分光計 (Nicolet Nexus 470、Thermo Electron Corporation、Waltham、MA、USA) を使用して波数 400 ～ 4000 cm-1 で収集されました。

粉末化ナイシン-SACD 複合体の結晶構造は、市販の機器 (D2 PHASER、ブルカー、ドイツ) を使用し、操作電圧 40 kV、回折角 (2θ) 範囲 4 から 4 °C で X 線回折分析 (XRD) を使用して決定されました。 °～40°。

ナイシン-SACD 複合体の熱挙動は、熱重量分析 (TG) 分析システム (TGA2、メトラー・トレド、スイス、シュヴェルツェンバッハ) を使用し、N2 (50 mL/分) 下、10 °C/分の加熱速度で一定温度にわたって評価されました。 30～600℃の範囲です。

ナイシン-SACD の安定性に対する pH の影響を評価するために、可溶化の 10 日後に複合体溶液中のナイシンの量を測定しました。保管期間は、錯体形成プロセスが完全な平衡に達することを保証する予備実験に基づいて設定されました。ナイシン-SACD 複合体の熱安定性も、121 °C で 30 分間高圧蒸気滅菌処理にさらすことによって評価されました。ナイシン-SACD 複合体内に可溶化されたナイシンの割合は、紫外可視分光光度計 (UV-1800PC、マパダ、中国) を使用して 201 nm での吸光度を測定することによって決定されました。対照群として、ナイシンの懸濁液に対して同様の手順を実施した。次に、次の式を使用して保持指数 (RI) を計算しました。

サンプルの抗菌活性は、代表的なグラム陽性菌として黄色ブドウ球菌 (ATCC 6538) を使用して測定されました。光学密度 (OD) は、ナイシンおよびナイシン - SACD 複合体の抗菌活性を評価するために使用されました 41,42。細菌をルリア・ベルターニ培地上で37℃で24時間前培養して、種培養物を得た。次に、これらの種培養物を、Luria-Bertani 培地を使用して 106 CFU に希釈しました。 1 mg のナイシン、50 mg のナイシン-SACD (1 mg のナイシンを含む)、および 50 mg の SACD を秤量し、10 mL の希釈細菌培養液に別々に加えました。サンプルを含まない細菌培養物をブランク対照群として使用しました。 37 °C で 24 時間インキュベートした後、紫外可視分光光度計 (UV-1800PC、マパダ、中国) を使用して 600 nm での OD (OD600) を記録することによって、培地内の細菌の増殖を測定しました。

ナイシン-SACD複合体の抗菌活性を確認した後、Liらによって報告されているように、ブロス微量希釈法によってナイシン-SACD複合体のMICをさらに測定した。 40. ナイシン、SACD、ナイシン-SACD、および高圧蒸気滅菌ナイシン-SACD (HSS-nisin-SACD) の初期濃度を 400 μg/mL、40 mg/mL、40 mg/mL (400 を含む) に設定しました。それぞれ、μg/mL ナイシン)、および 40 mg/mL (400 μg/mL ナイシンを含む)。次に、初期溶液の濃度がそれぞれ 3.125 μg/mL、0.3125 mg/mL、0.3125 mg/mL、および 0.3125 mg/mL に達するまで段階的に希釈しました。次に、さまざまな濃度のサンプル 100 μL を、96 ウェルプレートで 106 CFU 細菌を含む黄色ブドウ球菌希釈液 100 μL とともに培養しました。プレートを 37 °C で 24 時間インキュベートしました。 OD600がブランク群(細菌接種なし)の濃度と有意に異ならなかった濃度をMICとした。 MICでナイシン-SACDおよびHSS-ナイシン-SACDで処理した黄色ブドウ球菌を、生/死菌二重染色キット(LMAI Bio、中国)を使用してさらに染色し、総細菌数と死菌数を蛍光によって表すことができました。強度値を直接設定します。細菌全体と死んだ細菌は 2 つの異なる蛍光色素で染色されているため、細菌全体の蛍光強度との間に統計的関係がないことに注意してください。

ナイシン-SACD、SACD、およびナイシンで培養した後、走査型電子顕微鏡 (SU8100、SEM、日立、日本) を使用して細菌の形態を視覚化しました。サンプルはカーボンブラックテープ上に堆積され、分析前に金でコーティングされました。

すべての測定は、別々のサンプルに対して 3 回実行されました。数値を与えた結果は、平均値±標準偏差として表示されます。実験データの ANOVA 分析は、SPSS 20 統計ソフトウェア (SPSS Inc.、シカゴ、米国) を使用して実行されました。差異は有意水準 95% で考慮されました (p < 0.05)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文で入手可能であることを宣言します。

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この研究は、江蘇省自然科学財団 (BK20210458) の支援を受けました。

214122、中国、江蘇省無錫、江南大学、江蘇省食品安全・品質管理共同イノベーションセンター、食品科学技術学部、食品科学技術国家重点実験室

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リー・シャオジン

寧波大学食品薬学部、169 Qixing South Road、寧波、浙江省、315832、中国

シャンユアン・サン

マサチューセッツ大学食品科学部、アマースト、マサチューセッツ州、01060、米国

デビッド・ジュリアン・マクレメンツ

食品栄養と人間の健康のための北京先進イノベーションセンター、中国-カナダ食品栄養と健康の共同研究室（北京）、北京科技ビジネス大学（BTBU）食品健康学部、11 Fucheng Road、Beijing、100048、中国

ワン・ジンペン

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YH: 概念化、方法論、ソフトウェア、検証、正式な分析、調査、データキュレーション、執筆 - 原案、および視覚化。 KX: 調査。 XL: 資金調達とリソース。 SS: 正式な分析。 DJM: 執筆 - レビューと編集。 LC: 方法論と形式的分析。 JL: 資金の獲得とリソース。 AJ: 資金の獲得とリソース。 XX: 資金の獲得とリソース。 JW: 資金調達、概念化、リソース、監督、およびプロジェクト管理。 ZJ: 資金調達、概念化、監督、プロジェクト管理。 CQ: 資金調達、リソース、および方法論。

Jinpeng Wang、Zhengyu Jin、または Chao Qiu に対応します。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Hu, Y.、Xing, K.、Li, X. 他シクロデキストリンカルボキシレートは、幅広い適用条件におけるナイシンの安定性と活性を向上させます。 npj サイエンスフード 7, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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受信日: 2022 年 8 月 1 日

受理日: 2023 年 2 月 13 日

公開日: 2023 年 5 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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